溃疡性结肠炎相关性结直肠癌中AOM/DSS模型应用研究

吴 琼，郭 蒙，叶 华，朱宇珍，郑学宝

（1.广东医学院药理教研室，广东 湛江 524023；2.广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界第三大常见恶性肿瘤，CRC可由自发或慢性炎症发展而致。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是CRC发生除吸烟、饮食、家族遗传等因素外的一个致病因素，可以大大增加患CRC的风险[1]。慢性炎症的反复损伤、修复、增生、引起基因突变，从而引起细胞癌变，大约有20%的人癌症来源于慢性炎症[2]。结肠炎相关性结直肠癌(Ulcerative colitis associated colorectal cancer，UCACRC)动物模型的研究，有助于探索复杂的CRC发病和发展的机制，动物模型已经为肿瘤转移及特异性灵敏疗法提供了依据[3]，所以以人类诊断和治疗为导向的试验必须用动物模型做临床前研究。目前最常用的化学诱导IBD相关性CRC癌变的动物模型中，氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate，DSS)诱发的CRC动物模型可以成功模拟其全过程。本文主要探讨AOM/DSS动物模型的造模方法及UC相关CRC组织学特征，并探讨其主要特点以及诊断癌变途径的研究进展。

1 AOM/DSS动物模型

CRC的发生发展是一个长期的过程，正常上皮细胞通过隐窝异常发展为腺瘤进而发展为原位癌。CRC模型已经可以模拟人类的肿瘤病因和病理学改变，无论是体内还是体外模型均可以反映CRC发展的每一个阶段。AOM/DSS模型是使用最广泛的小鼠模型，AOM是一种化学致癌剂1,2-二甲基肼(1,2-dime-thylhydrazin，DMH)作用的DNA烷基化产物，可以由腹腔注射并经由胆汁代谢，由菌群代谢进一步激活AOM使其致癌[4]，AOM较DMH相比致癌效果增强且更加稳定。多次腹腔注射AOM导致在结肠远端产生肿瘤，其组织学特征类似于人类的CRC，要模拟CRC需要AOM与DSS结合造模。DSS为化学致炎剂，动物饮用含有DSS的饮水可以造成炎症性肠病模型，其病理学改变类似于人类溃疡性结肠炎。

AOM/DSS模型多应用于CRC发病机理的研究、预防CRC化学药物的研究、致癌环境的检测[5]以及肿瘤转移风险研究[6]。实验性结直肠癌的发生主要是由AOM/DSS模型诱发的异常隐窝病灶(Aberrant crypt foci，ACF)和腺瘤癌变形成，均依赖于剂量、诱导方式、诱导周期、根据不同的延长时间形成癌变[7]。Suzuki等[8]报道，选用 Balb/c、C2H/HeN、C57BL/6N、DBA/2N四种品系小鼠，在造模第一天给予单次腹腔注射AOM(10 mg/kg)，第二天给予含有1%的DSS自由饮用5 d，之后不做任何处理，至到实验第126天结束实验，观察到AOM/DSS模型在不同品系小鼠中结肠癌的发生敏感性存在差异；在4个近交系小鼠进行造模研究，其中结肠腺癌发生率在Balb/c小鼠中为100%，在C57BL/6N小鼠中为50%，在C3H/HeN小鼠中为29%，在DBA/2N小鼠中为20%。

AOM/DSS模型通过炎症和免疫组化的硝基酪氨酸阳性表达阳性率判断小鼠品系对其敏感度为：Balb/c＞C57BL/6N＞C3H/HeN＞DBA/2N。 最 近 研 究AOM/DSS模型造模方法相关报道如表1[8-15]。Tian等[12]和Shang等[13]报道，AOM/DSS模型可以导致其结肠腺癌发生率接近100%。

表1 AOM/DSS模型方法

2 在炎症相关癌症研究中AOM/DSS模型的应用

肿瘤发生是一个复杂的过程，包括启动、促进和发展。细胞癌变涉及到肿瘤细胞的变异、侵袭及增殖。促进肿瘤形成需要持续诱导和刺激，以及早期致癌物质对凋亡的抑制。在肿瘤形成初期，随着癌细胞增殖成纤维细胞也会转移到病灶处，发挥有益功能的细胞开始倒转过来对抗机体，通过刺激炎症而促进肿瘤生长[16]。炎症微环境可以影响肿瘤的发生和肿瘤形成[17]，从临床前研究和临床研究通过潜在分子机制已经证明炎症持续发生会导致肿瘤的发生，是发生癌变的高危因素[18]。流行病学研究显示，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)发生癌变的机制为：发炎黏膜增生性病变-不典型增生-癌变[19]。由炎症诱发的癌变机制包括：炎症诱导活性氧和活性氮产生、诱导的基因组不稳定、基因突变后的倍性、增强细胞增殖、基因异常表达、抗凋亡、肿瘤的血管可以新生以至于更具侵略性、穿透基底膜导致肿瘤转移。这些机制可以直接或是间接的通过损伤重要的细胞成分(例如DNA、蛋白质和脂质)，促进细胞恶性转化。炎症已经成为癌症的第七大特征，慢性炎症的持续刺激是多种肿瘤产生的关键原因。

AOM/DSS模型在炎症相关结直肠癌实验中具有重要意义，它是在肿瘤发生率相对较低的前提下，由标准的UC模型通过多周期DSS诱导和延长造模时间完善而制定。在AOM/DSS诱导3～4周后，小鼠结肠黏膜出现弥散性炎症，上皮隐窝异常，固有层呈现不规则形态并有大量炎症细胞表达(淋巴细胞，浆细胞)。研究中有大量肥大细胞迁移，可以发现其周围或是在其内部有癌变[20]。观察人类结肠炎相关性结肠癌的特征主要表现在免疫细胞浸润，包括巨噬细胞、T细胞(包括CD8+、CD4+效应T细胞和CD4+、CD25+T细胞)[21]。Garrett等报道，树突状细胞为T-Bet(-/-)RAG2(-/-)UC模型中炎症癌变的细胞感受器[22]。Mantovani等[23]报道，在AOM/DSS模型中形成肿瘤的第一阶段，可以观察到诱发癌症的两个条件——结肠炎和遗传/后生遗传在特定的微环境协调下，有助于促进肿瘤形成。在AOM/DSS模型中促进肿瘤生长的两个条件，炎症内在途径为炎症相关基因的表达促进肿瘤细胞基因改变，外在途径为在肿瘤微环境中促进炎症条件改变[23]。

在AOM/DSS模型中炎症促癌发生关键因子包括主转录因子(例如NF-κB和STAT3)、炎性细胞因子(TNF-α，IL-6)、COX-2和特定趋化因子。用于检查炎症介质包括IL-10、TCF-β、toll样受体(TLR)，IL-1受体抑制剂TIR8，趋化因子诱饵受体和清道夫受体D6。

3 在癌症研究中AOM/DSS模型的应用

大量实验已经证明AOM/DSS动物模型与人类CRC的发病机制相似。由于肿瘤诱导剂(AOM)和肿瘤促进剂(DSS)的协同反应。AOM/DSS模型较仅用AOM或DSS模型相比，可以呈现急性炎症的最初阶段和较短的潜伏期来再现CRC的发生机制。例如，啮齿动物自由饮用DSS，广泛应用于IBD模型，通过DSS诱导CRC需要长时间饮用或多周期饮用，并且肿瘤发病率较低。

Tanaka等[20]报道，AOM/DSS模型是给予Balb/c小鼠单次腹腔注射AOM(10 mg/kg)，自由饮用2%DSS一个循环，利用这种造模方法有多发性结肠肿瘤产生。DSS溶于饮水中其毒性作用于结肠上皮细胞，饮用DSS第一周其特征表现在小鼠体重减轻、血便。但是，这些现象在AOM/DSS诱导5周后，明显减轻。这个模型中的癌症发展密切反映人类肿瘤发展模式。小鼠给予AOM/DSS诱发的肿瘤准确的概括了被观察到的人类CRC发病机制。例如，肿瘤多发于结肠远端，这也是人类自发CRC的主要位置。肿瘤先由息肉状成长，并且其病理学特征与人类CRC相似。但是，AOM诱导的肿瘤往往缺乏黏膜侵袭性[24]。通过微观和宏观技术分析淋巴结和其他外周器官可能为考虑用于肿瘤转移相关的研究。

CRC发病是一个多因素多步骤的过程，这个过程是由正常隐窝形成ACF，隐窝裂变增殖形成微腺瘤，微腺瘤发展成肉眼可见腺瘤、腺瘤性息肉，最终癌变形成腺癌。因此，在形态和遗传学研究，这个多步骤过程为腺瘤癌变顺序[25]。在近交系Balb/c和远交系ICR-1易感小鼠中，AOM/DSS模型能有效地高再现性这个多步骤肿瘤发生过程。雄性小鼠中，从开始致敏到12周，结肠黏膜溃疡导致结肠炎，不典型增生，管状腺瘤，有80%～100%小鼠出现3～10个肉眼可见肿瘤[26-27]。利用固定好的结肠切片，通过亚甲基蓝染色可观察到结肠黏膜表面的结肠隐窝是否异常。

Roncucci等[28]报道在AOM/DSS诱导的3～4周可以观察到深染部分为偶然的，异常大的略凸起的“异常隐窝”。AOM/DSS诱导的肿瘤通常是由T淋巴细胞和其他免疫细胞浸润结肠壁，腺瘤增生恶性癌变为腺癌。AOM/DSS诱导的小鼠结肠中部和远端可观察到肿瘤呈结节状、息肉状和绒毛状。Ward等[29]报道，这些肿瘤是管状腺瘤或中度分化管状腺瘤。Tanaka等[20]报道，AOM/DSS诱导20周时，其管状腺癌发生率为100%，多发性腺癌发生率为38%。显微镜下观察，所形成的肿瘤特性是结肠上皮内形成的肿瘤，成瘤过程是从息肉的周边和非增生结肠上皮开始低度增生，到形成肿瘤的中央部位和黏膜下层浸润的高度增生。Pascal等[30]报道结肠黏膜发生的不典型增生多为轻度和重度不典型增生。轻度不典型增生，细胞核细长，排列较紧密，出现假复层，但细胞核极性正常，杯状细胞正常或略有减少；中度不典型增生，细胞核更加细长，排列紧密，假复层增多，但细胞极性仍正常，杯状细胞减少；重度不典型增生，细胞核增大，为圆形或卵圆形，核染色质变粗，并出现明显核仁，排列紧密，出现共壁、筛网结构，或腺管上皮细胞增生，连接成网状，核极性紊乱，存在众多有丝分裂，杯状细胞明显减少。若出现上述重度不典型增生现象可以确定腺瘤已癌变，有时腺瘤的细胞和组织学还处在不典型增生阶段时，但肿瘤组织已突破黏膜肌层向黏膜下层浸润并向周围纤维组织发展，也可以确定腺瘤已癌变。

4 展望

在过去的二十年中，CRC小鼠模型提供了IBD向CRC发展相关的病理组织学和分子学机制，有助于我们了解人类IBD向CRC发病的机制。在动物模型中，化学诱导CRC小鼠模型已被证明是非常有价值的，而其中AOM/DSS模型为更加稳定的重要工具。AOM/DSS模型表明在短时间内动物受影响且肿瘤发病率很高，可以预见和监测的肿瘤发展，可以再现人类CRC发生发展的过程。在AOM/DSS模型的平台上，开发CRC的化学预防药物，观察其诊断、预后和预测指标，在临床前应用是非常有价值的。将来对AOM/DSS模型进一步完善，在开发新的和更复杂的分子工具与遗传学结合应用，可能让我们来重新定义CRC相关疾病。利用该模型的完善，更有助于观察及控制癌前病变研究。

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