双酶水解四角蛤蜊工艺优化研究

2013-09-03蒋金来王令充刘小莉朱蕴菡

食品工业科技 2013年2期

蒋金来，王令充，吴皓，刘睿，刘小莉，朱蕴菡，刘新

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210046；2.南京中医药大学中药学一级学科，江苏南京 210046）

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）为软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），蛤蜊科（Mactridae）的动物[1]，广泛分布于我国南北各海区，生活于沿海的潮间带，别名蛤剌、沙蛤、沙蜊，白蚬子等，其贝壳和软体均可入药，软体部含有丰富的蛋白质和多糖等营养成分，且肉味咸寒，具有润五脏、止消渴等功效[2]，是具有研究开发潜力的药用海洋生物。随着近代科学技术的进步和人们对海洋湖沼资源认识的提升，对海洋湖沼生物资源的研究开发不断深入，已成为新产品研发的热点之一[3]。对四角蛤蜊进行药学研究和产品开发可以将低值海洋生物资源进行高值利用，具有重要的意义。近年来利用蛋白酶水解蛋白的研究日益剧增，对四角蛤蜊蛋白水解的研究亦逐步增加。目前对四角蛤蜊的酶解仅局限于单酶水解法[4]，采用的单酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶[5-6]，而对其双酶复合水解[7]的研究尚未报道，蛋白质的水解不仅需要内切酶，而且需要外切酶的参与，内切酶只能将蛋白质水解为多肽及少量的氨基酸，外切酶是从肽链的N端或C端将多肽水解为氨基酸，所以在水解蛋白质时，要有内切酶和外切酶的双酶共同作用才能得到高氨基酸含量的复合氨基酸液。本实验采取内-外两步酶解法水解四角蛤蜊，以期为海洋蛋白高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

四角蛤蜊采自江苏省南通茅家港，经清水吐沙后取鲜肉弃壳备用；胰蛋白酶活力5万U/g，Amresco公司；胃蛋白酶（3000U/g）、木瓜蛋白酶（80万U/g）、菠萝蛋白酶（30万U/g）、中性蛋白酶（5万U/g）、酸性蛋白酶（5万U/g）、碱性蛋白酶（20万U/g）、风味蛋白酶（2万U/g）、复合蛋白酶（12万U/g）南京奥多福尼生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

BP 211D型电子天平德国Sartorious公司；RotavaporR－210型旋转蒸发仪德国BUCHI公司；pHs－3C型精密pH计上海精密科学仪器有限公司；JJ－2型组织捣碎匀浆机江苏省金坛市荣光仪器制造公司；Avanti J－25高速冷冻离心机德国Backman公司；SHZ－III型循环水式真空泵南京科尔仪器设备有限公司；Unique－s15型超纯水仪厦门锐思捷科学仪器有限公司；DF－101S型集热式恒温加热磁力搅拌器巩义市子华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液制备方法将四角蛤蜊软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次0.5h，沥干，称重，加3倍量水匀浆，再加入酶进行酶解，结束后于95～100℃水浴灭活10min，然后于6000r/min离心15min得上清液为酶解液。

1.2.2 测试指标与测定方法氨基态氮含量用甲醛滴定法[8]测定；总氮回收率（%）=酶解液中氮含量/原料中总氮含量×100，酶解液和原料中总氮含量用凯氏定氮法[9]测定。

1.2.3 最佳内切酶的选取在加酶量、固液比和酶解时间一定的前提下，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶7种酶酶解四角蛤蜊，以酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率为评价指标，选出水解效果最好的内切酶。实验设计见表1。

表1 不同内切酶的酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions of different incision enzymes

1.2.4 内切酶条件优化以1.2.3选取的酶解效果最好的酶为目标内切酶，以氨基酸态氮含量和总氮回收率作为指标，选择酶用量、pH、温度、时间等因素做单因素实验，然后每个因素确定3个水平，按L9（34）正交表进行正交实验，以优化内切酶解条件，正交实验因素与水平见表2。

表2 正交实验因素与水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 外切酶的筛选在内切酶解液的基础上做外切酶解实验，当加酶量、固液比和酶解时间固定时，用风味蛋白酶和复合蛋白酶酶解内切酶解液，以最后酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率水平评价效果最佳外切酶。实验设计见表3。

表3 不同外切酶的酶解条件Table 3 Hydrolysis conditions of different excision enzymes

1.2.6 外切酶条件的优化以1.2.5筛选的最佳酶解效果的酶为外切酶，以氨基酸态氮含量和总氮回收率作为指标，在单因素实验的基础上，选择酶用量、pH、温度、时间四因素并每个因素选取3个水平，按L9（34）正交表进行正交实验，以优化外切酶解条件。正交实验设计见表4。

表4 正交实验因素与水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 内切酶的选择

从表5中可以看出，7种内切酶中，中性蛋白酶的酶解效果最好，胰蛋白酶和碱性蛋白酶次之，其他四种酶的酶解效果较差，由此确定中性蛋白酶为目标内切酶。

表5 不同内切酶的酶解效果比较Table 5 Effect of incision enzymes on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.2 内切酶单因素实验

2.2.1 酶用量对酶解效果的影响结果见图1，如图1示，当底物量一定时，随着酶用量的增加，酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率迅速增加，当酶用量大于1500U/g肉时，酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率增加量逐渐降低，且变化量很小，说明对水解效果的影响已开始减弱，这是因为随着水解产物的增加，酶活力开始受到抑制，同时，考虑到成本因素，酶用量应以1500U/g为宜。

图1 酶用量对酶解效果的影响Fig.1 Effect on enzyme dosage on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.2.2 温度对酶解效果的影响温度影响蛋白酶催化反应速度及其稳定性，从而影响酶解反应的效率。为此，设定固液比1∶3，酶用量为1500U/g肉，初始pH为7.0，分别在40、45、50、55、60℃条件下酶解，4h后测定水解液中氨基态氮含量和总氮回收率，结果见图2。

图2 温度对酶解效果的影响Fig.2 Effect of temperature on the hydrolysis of Mactra veneriformis

如图2所示，随着温度的升高氨基酸态氮含量和总氮回收率不断增加，50℃时均达到最大值，继续升温，氨基态氮含量和总氮回收率反而降低。这是因为温度过高，引起了酶分子结构次级键解体，导致蛋白质变性，使得酶活力减弱[10]。因此，酶解的适宜温度为50℃。

2.2.3 时间对酶解效果的影响时间影响蛋白酶酶解程度及其酶活力，从而影响酶解反应的效果。为此，设定固液比1∶3，酶用量为1500U/g肉，初始pH为7.0，于50℃下分别酶解2、4、6、8、10h，然后测定水解液中氨基态氮含量和总氮回收率，结果见图3。

图3 时间对酶解效果的影响Fig.3 Effect of time on the hydrolysis of Mactra veneriformis

从图3中可知，随着时间的延长，酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率逐渐增加，当酶解6h后，酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率增加量变少，说明酶活力开始减弱，因此应酶解6h为宜。

2.2.4 pH对酶解效果的影响设定固液比1∶3，酶用量为1500U/g肉，温度50℃，分别在初始pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下酶解，6h后测定水解液中氨基态氮含量和总氮回收率，结果见图4。

图4 pH对酶解效果的影响Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis of Mactra veneriformis

图4结果表明，由于目标内切酶是中性蛋白酶，因此在中性条件下，对四角蛤蜊的酶解效果最好。当pH为7.0时，氨基酸态氮含量和总氮回收率最高，故酶解的适宜初始pH为7.0。

2.2.5 固液比对酶解效果的影响分别设定固液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，加酶量为1500U/g肉，温度50℃，在初始pH7.0条件下酶解6h，灭酶后测定酶解液中氨基态氮含量和总氮回收率，结果见图5。

图5 固液比对酶解效果的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of Mactra veneriformis

由图5可以看出，随着固液比的增加，氨基酸态氮含量和总氮回收率有一个先升后降的渐变趋势，这是因为固液比过大，会使酶解产物增量太快，反过来抑制酶解反应，并且固液比对酶解效果的影响不是很明显。故实验最终将固液比定为1∶3（g/mL）。

2.3 内切酶解条件优化

在单因素实验基础上，考虑到以上各因素对酶解效果的综合影响，选择酶用量、pH、温度、时间四因素三水平L9（34）进行正交实验，确定中性蛋白酶最佳酶解条件，正交实验结果见表6和表7。

由表6中R值及表7中方差分析可知，综合氨基态氮含量、总氮回收率两个指标，影响内切酶解效果的主次因素为加酶量＞温度＞时间＞pH，其最优条件是A2B1C2D3，进一步显著性检验表明，加酶量对酶解效果具有显著性影响（p＜0.05）。因此根据正交实验分析结果，四角蛤蜊肉内切酶解最适宜条件为加中性蛋白酶1500U/g肉，调初始pH7.5，于45℃下酶解6h。

表6 正交实验设计与结果Table 6 The results of orthogonal experiment

表7 内切酶水解氨基氮含量方差分析Table 7 Incision enzymes hydrolysis amino nitrogen content of variance analysis

2.4 外切酶解的筛选

在内切酶解液基础上进行下一步酶解以筛选最佳外切酶，从表8可以看出，风味蛋白酶和复合蛋白酶比较，后者的氨基氮含量和总氮回收率均明显高于前者，因此确定复合蛋白酶为外切酶。

表8 不同外切酶的酶解效果比较Table 8 Effect of excision enzymes on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.5 外切酶解条件的优化

根据文献报道[11-13]及单因素实验，在中性蛋白酶酶解液基础上选择温度、pH、加酶量、时间四因素三水平按L9（34）进行正交实验，以优化外切酶解条件，正交实验结果见表9和表10。

由表9中R值及表10中方差分析可知，各因素对外切酶解效果的影响程度为pH＞加酶量＞时间＞温度，其最优条件是A1B3C3D3，其中pH为外切酶解效果显著性影响因素（p＜0.05）。因此根据正交实验分析结果，外切酶解最适宜条件为加复合蛋白酶4200U/g肉，调初始pH7.0，于45℃下酶解11h。在此内-外两步酶解条件下，四角蛤蜊肉酶解产生氨基态氮含量为20.78mg/g，其总氮回收率为88.19%。

表9 正交实验设计与结果Table 9 The results of orthogonal experiment

表10 外切酶水解氨基氮含量方差分析Table 10 Excision enzymes hydrolysis amino nitrogen content of variance analysis

3 结论

以四角蛤蜊为原料，用氨基酸态氮含量和总氮回收率为指标，通过对比实验确定四角蛤蜊内-外两步酶解的酶种，并在单因素实验的基础上，通过正交实验确定了内-外两步酶解的最佳条件为：先添加中性蛋白酶1500U/g肉，酶解温度45℃，固液比1∶3（V/W），初始pH7.5，水解6h，灭活后改变条件，温度45℃，初始pH7.0，固液比1∶3（V/W），添加复合蛋白酶4200U/g肉，在此条件下酶解11h。通过实验验证，中性蛋白酶和复合蛋白酶内-外两步酶解具有较好的水解效果，可酶解产生氨基氮含量为20.78mg/g，其总氮回收率为88.19%。

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