蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化性能的变化

蒋增良，毛建卫，4，*，黄 俊，吴元峰，蔡成岗，樊 诵2，

（1.浙江理工大学理学院，浙江杭州310018；2.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；3.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；4.浙江科技学院，中德农产品加工工业研究院，浙江杭州 310023）

微生物酵素指以一种或多种新鲜蔬菜、水果等为原料，经多种有益菌发酵而产生的，含有丰富的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品，它具有抗衰老、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫能力及解毒抗癌等多种保健功能[1]。人类的多种疾病如衰老、动脉硬化、炎症性疾病、糖尿病、癌症等，被证实与活性氧和自由基有关[2－4]。Kris－Etherton等研究表明富含抗氧化成分的食品在防治自由基引起的疾病方面有重要的作用[5]。目前对氧化性能的研究还较少，微生物酵素呈现出来的抗氧化性能部分可能来自发酵过程，但机理尚不清楚。所以，阐明发酵过程中微生物酵素抗氧化性能的变化规律是很有必要的。本文以蓝莓为原料，研究天然发酵过程中还原力、DPPH自由基、羟基自由基、超氧自由基和ABTS自由基清除能力的变化，以及与总酚含量的相关性，以期为进一步阐明微生物酵素产品的保健功能机理和综合性开发提供一定的理论基础和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓 采自浙江省绍兴市的有机水果基地；红糖 一级品，市购；α，α－二苯基－β－苦苯肼（DPPH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、硝基四氮咪唑蓝（NBT）、2，2－联氮基－双－（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）二氨盐（ABTS）Sigma Chemical Co.（圣路易斯，美国）；其他所用到的化学试剂 分析纯，国药化学试剂有限公司（上海，中国）。

TGL－16M高速立式冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；可见光－紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；HH－6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；Sartorius普及型pH计（PB－10）上海安因科技有限公司；SW－CJ－1F型单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓酵素的制备 用无菌水在无菌条件下轻轻地冲洗蓝莓以除去表面沙子和灰尘等，在无菌操作台中自然晾干。红糖用紫外杀菌45min。蓝莓与红糖按质量比1∶1，加入到已灭菌的玻璃瓶中，封口，放在暗处，常温下发酵56d。为了避免潜在的菌体污染，制备过程中所有操作都在无菌条件下进行。在发酵过程中，每隔8d取样，样品经高速离心机10000r/min离心10min后，用于测定。

1.2.2 总酚含量测定[6]100μL样品加入到45.9mL去离子水，再加入1mL Folin－Ciocalteau试剂，反应3min，最后加入3mL 20%的碳酸钠溶液，25℃恒温水浴振荡2h，在760nm下测定吸光度，以去离子水为参比溶液。总酚含量以没食子酸等价物表示，按照标准曲线线性方程y=0.0917x+0.0208，R2=0.9996来测定总酚含量。其中：y为吸光度，x为样品浓度（GAE，μg）。

1.2.3 DPPH自由基清除能力[7]40μL样品加入到4mL 0.1mmol/L DPPH－甲醇溶液中，再加入450μL 50mmol/L Tris－HCl buffer（7.4），25℃下恒温水浴30min。以去离子水为参比溶液。在517nm下测定吸光度。

DPPH自由基清除能力（%）=[（A0－（A1－A2））/A0]×100 式（1）

式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。

1.2.4 还原力测定[8]30μL样品加入到2.5mL磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.6），然后加入2.5mL 1%铁氰化钾（w/v），50℃，反应30min，再加入10%三氯乙酸（w/v）2.5mL，在3000r/min下离心10min，立即取2.5mL上清液，加入2.5mL去离子水和0.5mL 0.1%三氯化铁（w/v）。以去离子水为参比溶液。在700nm下测定。吸光度值越高，还原力越强。

1.2.5 超氧自由基清除能力[9]50μL样品加入到950μL磷酸缓冲液（0.1mol/L pH7.4），然后加入1mL 120μmol/L PMS（用磷酸缓冲液配制），1mL 936μmol/L NADH（用磷酸缓冲液配制）和1mL 300μmol/L NBT（用磷酸缓冲液配制）。在环境温度下，反应5min。以去离子水为参比溶液。在560nm下测定吸光度。超氧自由基清除能力计算按照式（1）。

1.2.6 羟基自由基清除能力[10]135μL样品加入到1.4mL 6mmol/L H2O2，然后加入0.6mL 20mmol/L水杨酸钠和2mL 1.5mmol/L硫酸亚铁，37℃下恒温水浴1h。以去离子水为参比溶液。在562nm下测定吸光度。羟基自由基清除能力计算按照式（1）。

1.2.7 ABTS自由基清除能力[11]用7mmol/L ABTS（用5mmol/L的PBS，pH7.4配制），加入过硫酸钾最终浓度为2.45mmol/L，在室温下黑暗放置12h～16h。使用前把ABTS自由基用PBS稀释成在734nm下吸光度为0.7±0.02。

取10μL样品加入到5mL上述稀释液中，在30℃下，反应5min。以去离子水为参比溶液。在734nm下测定吸光度。ABTS自由基清除能力计算按照式（1）。

2 结果与分析

2.1 蓝莓酵素发酵过程中pH的变化

发酵过程中蓝莓酵素pH随发酵时间的变化，结果如图1所示。

图1 发酵过程中pH变化Fig.1 Changes in pH value during fermentation

由图1可知，蓝莓酵素的pH在前8d内快速从5.71下降到4.48，之后趋于缓和，只有小幅度的间歇性上升和下降，说明蓝莓酵素初期发酵快速，8d后进入慢发酵阶段。pH的下降是由于在发酵过程中发酵液中有机酸的浓度增加导致[12]。pH间歇地升高可能是由于微生物对蛋白质的水解和对氨基酸的利用导致[13]。

2.2 蓝莓酵素发酵过程中总酚含量的变化

本研究采用Folin－Ciocalteau法测定总酚含量，这是一个在恒温下伴随有磷钨酸和磷钼酸参与的复杂的还原反应，吸光度越高，总酚含量越高。发酵过程中蓝莓酵素总酚含量变化结果，如图2所示。

图2 发酵过程中总酚含量的变化Fig.2 Changes in total phenolic compounds during fermentation

由图2可知，随着发酵时间的延长，蓝莓酵素发酵液中总酚含量呈逐渐上升趋势，发酵56d总酚由发酵前的1.850mg/mL增加到2.308mg/mL。发酵前16d增幅明显，发酵56d后比未发酵时增加了24.7%。Chu Sheng-che等[14]的研究表明总酚含量的增加与微生物把复杂的大分子酚类物质转化成小分子酚类物质有关，说明发酵后抗氧化成分含量增加了。

2.3 蓝莓酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化

DPPH自由基是一个以氮为中心的脂溶性的自由基，相对于其他方法，被广泛的运用于评价短时间内的抗氧化活性。DPPH自由基比羟基自由基和超氧自由基更稳定，这使得它更有利于运用于抗氧化性的评价[15]。蓝莓酵素在发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化，结果如图3所示。

图3 发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化Fig.3 Changes in DPPH scavenging ability during fermentation

由图3可知，蓝莓酵素DPPH自由基清除能力在发酵过程上升了3.6%，第48d的时候达到最高，清除率为94.41%。Fessenden等[16]研究认为酚类物质能很容易的给出一个氢离子并通过共振杂化而稳定，是具有高自由基清除能力的主要原因。

2.4 蓝莓酵素发酵过程中还原力的变化

蓝莓酵素在发酵过程中还原力的变化，如图4所示。蓝莓酵素的还原力在前8d内迅速从0.450上升到0.538，之后间歇性的小幅度变化，总体呈上升趋势。说明蓝莓酵素在发酵过程中抗氧化成分增加，发酵前后还原力提高了20.4%。

2.5 蓝莓酵素发酵过程中超氧自由基清除能力的变化

图4 发酵过程中还原力变化Fig.4 Changes in reducing power during fermentation

超氧阴离子自由基在活性氧的形成中发挥重要作用，如过氧化氢、羟自由基和单线态氧，这些物质都可以诱导脂类、蛋白质和核酸的氧化损伤[17]。本实验采用PMS/NADH—NBT体系测定超氧自由基清除能力。溶解氧通过PMS/NADH偶联反应产生超氧自由基，导致NBT减少，从而使吸光度增加，加入抗氧化剂后吸光度下降暗示着超氧自由基的消耗。蓝莓酵素在发酵过程中超氧自由基清除能力的变化如图5所示。

图5 发酵过程中超氧自由基清除能力的变化Fig.5 Changes in superoxide radical scavenging ability during fermentation

由图5可知，在56d发酵过程中，蓝莓酵素对超氧自由基的清除能力呈增长趋势，发酵前后增加了5.7%。第48d达到最大，清除率为56.66%。据报道，超氧自由基活性可能归咎于酚类物质自由的羟基的作用。此外，黄酮化合物分子的A环或B环上有多羟基取代和有自由的3-羟基取代基都可以呈现出超氧自由基清除能力[18]。

2.6 蓝莓酵素发酵过程中羟基自由基清除能力的变化

羟基自由基是生物体系产生的一种极具反应性的自由基，被认为在自由基病理学上具有高度损伤性，它的损伤能力几乎在每一个活细胞内都能发现[19]。本研究采用硫酸亚铁-过氧化氢体系产生羟基自由基，它是通过Fenton反应产生羟基自由基，利用水杨酸钠对羟基自由基的捕捉而产生一种很方便的检测方法。蓝莓酵素在发酵过程中羟基自由基清除能力的变化，如图6所示。

由图6可知，相对于其他自由基的清除能力，蓝莓酵素对羟基自由基的清除能力相对较低。蓝莓酵素对羟基自由基的清除能力在前8d内快速上升，在接下来的16d内急剧下降，第24d后又逐渐上升。第56d羟基自由基清除率为42.08%，与未发酵前相比增加了2.4%。

图6 发酵过程中羟基自由基清除能力的变化Fig.6 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation

2.7 蓝莓酵素发酵过程中ABTS自由基清除能力的变化

蓝莓酵素在发酵过程中ABTS自由基清除能力的变化，如图7所示。

图7 发酵过程中ABTS自由基清除能力的变化Fig.7 Changes in ABTS radical scavenging ability during fermentation

由图7可知，在发酵过程中，蓝莓酵素对ABTS自由基清除能力一直都在增加。在56d时，对ABTS自由基清除能力达到82.22%，与未发酵前相比增加了16.5%。Erel等[20]的研究表明高浓度的酚类物质具有更高的清除ABTS自由基的能力，它们的作用取决于分子量、芳香环的数量和羟基取代基的性质[21]。

2.8 蓝莓酵素发酵过程中抗氧化性能与总酚含量的相关性分析

蓝莓酵素在发酵过程中抗氧化性能与总酚含量的相关性分析，如表1所示。

表1 抗氧化性能与总酚含量的相关性Table 1 Correlation of antioxidant ability and total phenolic compounds

由表1可知，蓝莓酵素在发酵过程中还原力与总酚含量相关性不高，相关系数r=0.515，p＞0.01；羟基自由基清除能力与总酚含量的相关系数r=0.184，p＞0.01不具相关性；DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力与总酚含量均具有显著的正相关性，相关系数分别为0.952，0.860，0.975，p＜0.01。

3 结论

本研究表明以蓝莓为原料，经蓝莓固有的多种有益菌天然发酵而产生的蓝莓酵素产品具有优良的抗氧化性能。抗氧化性能变化规律研究表明：发酵过程中总酚含量、DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力总体呈逐渐增加趋势，还原力和羟基自由基清除能力呈现先增加后略微降低再增加的趋势；DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力与总酚含量均具有显著的正相关性；还原力与总酚含量相关性不高；羟基自由基清除能力与总酚含量不具相关性，且相对于其他自由基清除能力，清除率相对较低。本研究为进一步阐明微生物酵素的保健功能机理和综合性开发提供一定的理论基础和技术依据。

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