发酵梨酒中产香酵母的分离、鉴定及生物学特性的研究

2013-09-03张大为洪磊东

食品工业科技 2013年2期

张大为，张洁，洪磊东，张丹，高健，梁芳

（1.湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭 411201；2.陕西科技大学生命科学学院，陕西西安 710021）

梨属于蔷薇科植物，果实味道鲜美，含有多种维生素、微量元素及人体所需必需氨基酸等营养物质，具有生津止渴、润肺止咳的作用，是人们喜爱的常见水果之一。近年来，由于梨树种植技术的大力推广及国家对水果行业的重视，梨的种植面积及产量逐年增加。梨成为仅次于苹果和柑橘的第三大水果，产量居世界第一位。我国梨主要分布在陕西、山东、河北、辽宁、安徽等地，成为很多地方的支柱产业之一[1]。由于梨主要以鲜食为主，加工技术相对落后，所以总体上来说是处于供过于求的局面，但是消费者平均占有量还不及世界平均水平的一半，主要原因在于还没有从根本上解决水果行业发展的主要矛盾，即供求关系。开发梨酒是解决供求关系的一种行之有效的方法，同时也响应了我国关于酒业发展的指导思想，即以果酒逐步取代一部分粮食白酒的战略构想[2]。酒的风味主要取决于酵母的性质，除酿酒酵母外，非酿酒酵母也在果酒酿造中起到了很重要的作用[3]。以前非酿酒酵母被认为是引起果酒腐败的微生物，但近年来的研究证实了某些非酿酒酵母对酒的品质是有积极贡献的，尤其是产香酵母对果酒中醇类、酯类物质的生成起着重要的作用，可赋予果酒浓郁的发酵香，与产酒率高的果酒酵母混合发酵可得到风味更佳的果酒[4－7]。本实验从自然发酵的梨酒中分离得到的一株产香酵母，其产香浓郁，能在梨酒发酵中起到增香的作用。该菌种和本研究前期报道的酿酒酵母YDJ05配合使用，能起到增香的作用，也为利用YDJ05和该菌种进行原生质体融合来选育能够产香的酿酒酵母奠定基础[8]。本研究对该菌种的生物学特性进行了详细的研究，并通过分子生物学手段鉴定到种，为后期进一步研究和在梨酒中的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酥梨陕西蒲城；麦芽汁培养基陕西蓝马啤酒有限公司；自然发酵梨酒将采集成熟的梨，制备梨汁，调整糖度15°Brix，经28℃自然发酵9d；发酵培养基上述制得糖度为15°Bé的梨汁，115℃、20min灭菌备用；DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；其他如Tap酶、dNTPs等分子生物学试剂由上海生工生物工程技术服务公司提供。

BSP－400型生化培养箱上海博讯实业有限公司；SW－CJ－2F型超净工作台苏州苏洁净化设备厂；AUY－120型分析天平日本岛津公司；PB－10型pH计北京赛多利斯仪器系统有限公司；YXQ－LS－75SII型立式压力蒸汽灭菌器上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SZX10摄影显微镜日本OLYMPUS；MASTER－M型手持折光仪日本ATGO；PTC200型PCR仪美国BIO－RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌的分离取1mL自然发酵的梨酒，进行5个不同梯度的稀释（10－1～10－5），制成菌悬液，涂布固体麦芽汁培养基平板，每个稀释梯度涂布3个平板，经28℃培养2～3d。根据酵母的菌落及细胞特征（采用光学显微镜镜检），初步分离酵母菌并得到单菌落，保存至斜面培养基，编号并放入4℃冰箱中保存，备用。

1.2.2 酵母菌的筛选将上述斜面培养基中的酵母菌接入20mL发酵培养基的100mL三角瓶中，28℃培养2～3d后利用感官评定法选出产香浓郁且风味柔和的产香酵母菌，按GB/T 15038－2006测定发酵液的总酯、酒精含量、还原糖、总酸，再进行感官评定，筛选入选菌种。

1.2.3 入选产香酵母生物学特性的研究包括产香酵母的细胞形态、生长曲线、最适培养温度、最适pH、发酵过程中总酯的变化情况及耐受酒精的浓度。

1.2.3.1 细胞形态和生长曲线测定将产香酵母菌按照10%接种量接入到发酵培养基中，定期测定培养液的OD值（660nm），以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线，同时制作菌株的水浸片，在光学显微镜下获得显微镜照片（×40）。

1.2.3.2 最适培养温度的确定将酵母种子接入发酵培养基中，分别在20～34℃不同温度下恒温培养18h，在660nm下测定发酵液OD值，依照OD值大小确定其最适生长温度。

1.2.3.3 最适pH的确定选取pH范围为3.5～5.9，其余同上。

1.2.3.4 总酯的变化情况酵母的培养条件同上，每隔1d测定其产酯量。

1.2.4 产香酵母菌的分子生物学鉴定 26S rDNA D1/D2区序列分析。

1.2.4.1 DNA的提取离心收集5mL菌体，用pH8.0的TE缓冲液洗涤三次，弃上清液，沉淀备用。

1.2.4.2 26S rDNA D1/D2区的PCR扩增及PCR扩增产物纯化、测序[9]PCR扩增采用通用引物对ITS1（5’－GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG－3’）和TS4（5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’）。PCR反应体系（50μL）：10×PCR缓冲液，5.0μL；Mg2+（5mmol/L），3.0μL；dNTP（各5mmol/L），2.0μL；引物（20μmol/L）各1.0μL；Taq DNA聚合酶（1U/μL，MBI），1.0μL；模板2.0μL约20ng；去离子水35μL。扩增程序为：94℃，30s；52℃，30s：72℃，40s；30个循环后72℃ 8min。取5μL产物于1%的琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下观察结果。

1.2.4.3 系统发育树分析[9]运用BLAST软件在GenBank数据库进行同源序列搜索，根据同源序列搜索结果下载相关菌种的D1/D2区域序列，与供试菌株序列放在一起，用MEGA4.1软件进行匹配排列，采用邻接法进行系统树的构建，并用BOOTSTRAP程序进行1000次可信度分析。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离

按照1.2.1中的分离方法经过感官评定并配合显微镜镜检，分离得到46株具有产香能力的酵母其基本特征如表1所示。

表1 酵母的分离结果Table 1 Separation result of yeast

从分离结果来看，所得到的酵母特征与文献报道的果酒酵母特征相类似，具有典型性[3－7]。通过初步感官评定，生长菌落的培养基平板能够产生香气，是进一步筛选的前提条件。

2.2 产香酵母的筛选结果

通过感官评定法在上述酵母菌中得到4株产香浓郁且风味柔和的产香酵母分别命名为YS01～YS04，其产酯、酒精等指标如表2所示。

表2 各菌株第5d发酵结果Table 2 The fifth day fermentation results of the strains

从表2可以看出，产香浓郁且风味柔和的酵母中，YS03的产酯量最高，达到了0.33g/L，产酒精率为0.8%（v/v），糖利用率较低，其糖浓度与还原糖量分别为12.1Brix和0.084g/L，说明在梨酒发酵中即不影响发酵菌株的酒精产量，又能达到增香的目的，是优良的梨酒增香酵母。

2.3 产香酵母生物学特性的研究

2.3.1 YS03的水浸片显微照片如图1所示。

图1 菌株YS03的水浸片显微照片（10×40倍）Fig.1 Microscopic photos of water extraction of YS03 strain（10×40）

由图1可以看出菌株YS03具有典型的酵母形态，细胞均呈圆形或椭圆形，生殖方式为单端出芽生殖。

2.3.2 YS03的生长曲线菌株YS03的生长曲线如图2所示。

图2 菌株YS03的生长曲线Fig.2 Growth curve of YS03

从图2可看出，YS03的延迟期为0～4h，4h后进入对数生长期，直到16h后细胞数量趋于稳定，开始进入稳定期，经测定稳定期细胞数量为1.2×108个/mL。

2.3.4 YS03最适生长温度的确定 YS03的在麦芽汁培养基中的生长曲线如图3所示，其最适生长温度为28℃，最适生长温度的范围为26～32℃，生长温度范围较宽。

图3 YS03在不同温度下的生长曲线Fig.3 Curve of YS03 growth at different temperature

2.3.5 YS03最适生长pH的确定将YS03在28℃不同pH的梨汁中培养，其结果如图4所示。

由图4可看出，YS03的最适生长pH是5.5，在5.1～5.9之间均能生长较好，其适应性较强，与梨汁的自然pH非常接近。由于YS03长期生长在梨园的环境中，适应于梨自然的酸度，故在生产中不需要进行pH的调整，这样既简化了工艺流程，又减少了外来离子的干扰。

图4 YS03在不同pH下的生长曲线Fig.4 Growth curve of YS03 at different pH value

2.3.6 YS03在发酵过程中总酯的变化情况经感官初步评定以及发酵5d后的各项指标，确定YS03为产香酵母，其总酯的变化情况如图5所示，在梨酒前酵的6d内，总酯含量逐渐增加，发酵的第6d的香气最浓，其总酯含量达到0.38g/L，到第7d略有下降。

图5 菌株YS03在发酵过程中的总酯变化曲线Fig.5 Changes curve of the total ester in the fermentation

2.4 YS03的26S rDNA D1/D2区序列的鉴定结果

图6 菌株YS03基于26SrDNA D1/D2序列及Neighbor－Joining法构建的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree drawn from neighbor－joining analysis based on the 26SrDNA D1/D2 domain of YS03

YS03基于26SrDNA D1/D2序列及Neighbor－Joining法构建的系统发育树如图6所示，YS03（26SrDNA D1/D2序列登录号为JN204428）和具有代表性的21株酵母进行比对发现，与模式菌株Issatchenkia orientalis NRRL Y－5396及Issatchenkia orientalis SM两株酵母的相似度达到100%，故可断定YS03和上述两种酵母属于同一个种，即东方伊莎酵母命名为Issatchenkia orientalis YS03。