巴氏醋酸杆菌沪酿1.0 1乙醇氧化产醋酸关键酶的研究

朱小明，夏小乐，杨海麟，王 武

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214036）

醋酸菌是严格好氧菌，属于变形菌纲，有超过10个属的一类微生物[1]，它们是重要的工业微生物，广泛用于食醋生产。目前应用于工业的食醋生产主要是醋酸菌中的醋酸杆菌属和葡糖杆菌属[2]，二者均能将乙醇氧化生成醋酸。我国食醋酿造所用的醋酸菌主要是AS1.41和沪酿1.01，二者都属于醋酸杆菌属中的巴氏醋杆菌，前者酒精生成醋酸的转化率较高，但有过氧化作用，能进一步将醋酸氧化生成二氧化碳和水，后者的过氧化作用较弱[3－4]。食醋生产中醋酸发酵过程主要涉及到两种酶：乙醇脱氢酶（ADH）[5]和乙醛脱氢酶（ALDH）[6]，均结合于细胞膜上，位于细胞膜外侧，以PQQ[7－8]为辅酶的膜结合脱氢酶。在胞内同时存在着以NAD为辅酶的ADH和ALDH，但它们对乙醇的氧化只通过TCA途径和乙醛酸途径，并不参与乙醇氧化产醋酸[9]。底物乙醇在膜结合乙醇脱氢酶（ADH）的催化下生成乙醛，中间产物乙醛接着在膜结合乙醛脱氢酶（ALDH）的作用下生产醋酸[10]。越来越多的研究表明，醋酸发酵是依赖于细胞膜结合的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶完成的，其酶活水平直接影响着产酸。周秉承[11]的研究表明醋酸菌的产酸速率与菌ADH的活力有着极明显的相关性，产酸速率随着活力的升高而升高，反之亦然；Trcek等[12]比较了葡糖醋杆菌和巴氏醋杆菌发酵中的PQQ－ADH差异，发现葡糖醋杆菌能产更高浓度的酸，其PQQ－ADH的表达量也相应较多，且PQQ－ADH的特性也表现出差异。醋酸菌作为一类特殊的微生物，在醋酸发酵过程中既要有一定的乙醇耐受能力，也要有一定的醋酸耐受能力。乙醇氧化生产醋酸的代谢途径相对简单，由膜结合ADH和ALDH组成产醋酸的关键酶系。但在发酵过程中，这两者所表现出来的水平也不尽相同，大量的研究已经表明PQQ－ADH与产酸存在直接的关系，但对发酵过程中酶系的动态变化及与产酸之间存在的关系阐述较少。本实验将探究在发酵过程中脱氢酶系的变化规律，并揭示酶系与产酸的规律，同时探究底物乙醇及底酸乙酸对酶系的影响。通过对酶系酶活的调控，在酶系水平为提高产酸强度提供可能性，并为生产实践提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沪酿1.01 本实验室保藏菌种；葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、铁氰化钾、无水乙醇、40%乙醛、Triton X－100、柠檬酸、乙二胺二乙酸二钠盐、硫酸铁、十二烷基硫酸钠、95%磷酸 均为分析纯；液体种子培养基（g/L）葡萄糖10g，酵母粉10g，pH6.5，灭菌冷却至60℃以下，再加无水乙醇40mL；发酵培养基（g/L）葡萄糖10g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，无水硫酸镁0.5g，灭菌冷却至60℃以下，根据实验要求添加乙醇及底酸乙酸。

无菌操作台、振荡培养箱 江苏太仓实验设备厂；3K15高速冷冻离心机 德国sigma公司；SONICVC－130型超声细胞破碎仪 上海史佩林实验室装备有限公司；722型分光光度计 上海珂淮仪器有限公司；Bioflo115机械搅拌式发酵罐 美国NBS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 种子活化培养条件：将1mL种子甘油管接种于45mL种子培养基中，30℃，在170r/min下摇床培养20～24h。

摇瓶发酵培养：将活化的种子液按10%的体积分数比接种到500mL三角瓶的发酵培养基中，装液量90mL，30℃，170r/min摇床培养108h。

发酵罐发酵条件：将活化的种子液按10%的体积分数比接种到7.5L的发酵罐中，发酵培养基为3.5L，搅拌转速400r/min，通气量为0.2VVM，发酵温度30℃。

1.2.2 分析方法 菌体密度：可见分光光度计于600nm（OD600）处测定吸光度。

酸度测定：0.1mol/L标准NaOH溶液滴定法，以醋酸计。

粗酶液的获得：取相应时间的发酵液（100mL），于4℃，8000×g条件下离心10min，用50mmol/L（pH5.8）的磷酸盐缓冲液（KPB）洗涤2次，然后重新悬浮于该缓冲液中（0.1g湿菌体/3mL KPB），在冰浴下进行超声破碎，240W，3s/3s，总时间10min。破碎液作为粗酶液待用。

ADH、ALDH酶活的测定：参照WOOD氏法[13]，取0.5mL Mcllvaine缓冲液（pH4.0），1.0mol/L乙醇（乙醛）溶液0.1mL，粗酶液0.1mL，6%Triton X－100 0.1mL于10mL比色管中，25℃保温5min后加入0.1mol/L铁氰化钾溶液0.2mL，在25℃条件下放置反应5min（同时做空白对照），然后加入硫酸铁－Dupanol溶液0.5mL终止反应，25℃下放置20min，加入3.5mL蒸馏水混合后，用紫外可见分光光度计测定660nm光密度。在25℃、pH4.0条件下，1min氧化1μmol乙醇的酶量为1个酶活力单位；4.0光密度等于氧化1μmol乙醇。

酶活性（U/mL）=A660×1/4×1/5×1/酶液（mL）×稀释倍数

比酶活（U/mg）=酶活性（U/mL）/总蛋白（mg/mL）

2 结果与讨论

2.1 醋酸分批发酵实验

将活化的种子液接入发酵培养基中，定时取样分析，结果如图1所示。醋酸菌产醋酸过程大致分三个阶段，即高速积累期（0～42h），平缓增长期（42～60h），同化消耗期（60h～）。在发酵前期，菌体活力强，产酸较快。随着菌体生长进入末期，菌体活力下降，此时产酸较慢。进入发酵末期，底物乙醇基本被消耗殆尽，醋酸菌产生过氧化现象，进入TCA途径，同化醋酸生成水和二氧化碳[14]。

图1 醋酸菌醋酸生成及酒精消耗与发酵时间的关系Fig.1 Acetic acid production and ethanol consumption in the fermentation process

2.2 醋酸发酵过程中ADH和ALDH酶活的动态分析

7L发酵罐中装入3.5L发酵培养基，灭菌后加入5%的乙醇（v/v），按10%的接种量接入种子进行发酵。定时取样，按上述方法测定样品的ADH和ALDH的酶活，结果见表1。从表1中可以看出，在整个醋酸发酵过程中，醋酸菌的ADH和ALDH的酶活成动态变化。发酵过程中，醋酸菌具有较高的ADH酶活性，并于36h达到酶活峰值，为8.21U/mg；醋酸菌在24～42h间以较高速率积累醋酸，而在42～60h积累速度明显放缓。醋酸发酵进入到60h之后，ADH酶活进入低水平阶段，醋酸开始出现同化现象。与ADH相似，ALDH在24～48h间酶活处于高水平，同样在36h到达酶活峰值。但相对于ADH，ALDH在整个发酵过程中酶活水平始终较低。ADH、ALDH作为乙醇氧化代谢生成醋酸途径中的两个关键酶，其酶活水平与产酸速率之间可能会存在着对应关系。表1同时反映了在发酵过程中比产酸速率与酶系水平的关系：在酶活水平较高时，比产酸速率也较快。在发酵初始阶段，菌体在适应新的环境，菌体生长处于延滞期，此时ADH和ALDH的酶活很低，可能此时酶系还未进行大量诱导表达，此时产酸速率和比生长速率接近于零。随着菌体生长进入对数生长，比生长速率处于较高的水平，此时酶活水平显著提高，产酸速率也同步加快，发酵液中开始积累大量的醋酸；随着发酵进入稳定期及后期，比生长速率不断下降，酶活水平也呈急剧下降趋势，ADH由最高的8.21U/mg下降到了接近于零，在这一时期，产酸速率一直下降至趋于零。

表1 醋酸发酵过程中关键酶系酶活力和比产酸速率Table 1 The specific activities of the key ezymes and specifice acetic acid production rate in the fermentation process

2.3 底物乙醇浓度对乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）表达的影响

在500mL三角瓶中装入90mL发酵培养基，灭菌后分别加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%不同浓度的乙醇，按10%的接种量接入种子。分别培养到菌体对数生长后期，将发酵液于4℃，8000×g条件下离心，按上述方法进行超声破碎并进行ADH和ALDH酶活测定，结果见表2。

图2 不同底物乙醇浓度下发酵乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的酶活变化特征Fig.2 Enzyme activities of ADH and ALDH in different ethanol concentration

从图2可以看出，在不同底物乙醇浓度下，醋酸菌的ADH和ALDH的活性水平发生改变。在没有乙醇的发酵条件下，ADH和ALDH的酶活水平很低，分别为0.38U/mg和0.28U/mg。在乙醇浓度1%～3%（v/v）间，随着培养基中乙醇浓度的升高，ADH和ALDH的酶活水平也提高，并在3%乙醇浓度时，ADH和ALDH的活性水平达到最高，分别为3.79U/mg和2.36U/mg。随着乙醇浓度的再升高，ADH和ALDH的活性又开始下降；当乙醇浓度到达7%时，ADH和ALDH的酶活水平降到了很低的水平。这与发酵过程中的菌体的生长表现是一致的，在乙醇浓度较低时，菌体生长活跃，产酸较快。随着浓度的升高，菌体生长受到抑制，产酸速率也相对较慢。同时，由图2可以看出，乙醇的存在对ADH和ALDH基因的表达存在诱导作用，但这种诱导是在一定的浓度范围内，如超过这个浓度范围，反而又不利于ADH和ALDH基因的表达。因此，在实际生产液醋过程中，可以通过控制发酵醪中乙醇的浓度在ADH和ALDH酶活水平较高的范围内，从而提高生产强度，达到从酶学水平调控发酵的目的。单纯从乙醇浓度对ADH和ALDH酶活的影响，可以选择3%乙醇浓度作为发酵培养基的初始乙醇浓度，对于半连续发酵，控制乙醇浓度为3%（v/v）能够使双酶的活性维持在一个较高的水平，对于生产具有实际意义。

2.4 底酸对乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的影响

醋酸作为醋酸菌发酵的产物，初始培养基中其存在与否会对发酵产生一定的影响[14－15]，而酶系水平较无底酸的情况下可能会存在一定的差异。在发酵培养基中添加底酸，进行发酵罐发酵，考察底酸存在下酶系的变化规律。7L发酵罐中装入3.5L发酵培养基，灭菌后加入4%的乙醇（v/v），同时加入1%的乙酸，按10%的接种量接入种子进行发酵。定时取样，结果分别见图3及表2。

图3 底酸条件下醋酸发酵特征变化Fig.3 The fermentation feature parameters in the condition of initial acetic acid

在经历了5h左右的延滞期后，发酵进入快速生长的对数期，乙醇也开始被快速消耗，同时酸不断积累，发酵进行到20h左右，乙醇基本被氧化殆尽，产酸也基本结束，菌体此时增长缓慢。和没有初始底酸的培养条件相比（图1），发酵进程明显加快。同时，ADH和ALDH的酶活水平也出现明显差异（表2）。

与在没有底酸的条件下的发酵对比，发酵时间大大缩短，产酸速率得到了较大的提高，发酵时间缩短到20h左右，说明底酸的存在对发酵有积极的促进作用。从酶系的变化来看，ADH和ALDH的比酶活都得到了较大的提高，尤其是ALDH的活性水平，最高比酶活提高了有3倍之多，最高酶活达到了7.46U/mg。二者酶活之间的差异变小，由ADH/ALDH从3.3（36h，表1）减小到了1.17（18h，表2）。

表2 底酸存在下乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的随时间的变化特征Table 2 The change of ADH and ALDH specific activities in the presence of initial acetic acid

在乙醇氧化生成乙酸的代谢途径中，ALDH催化乙醛生成乙酸。底酸（乙酸）的存在可能存在一种反馈激活作用，促进双酶基因的表达，特别是ALDH，从而大幅提高ALDH的酶活。因此，在生产中，在初始发酵培养基中添加一定的酸（1%），提高ADH和ALDH的酶活水平，从而达到促进发酵、提高生产强度的目的。

3 结论

通过对摇瓶、发酵罐发酵对醋酸菌产酸关键酶系进行研究，拟探讨其与产酸的关系。在分批发酵中，ADH和ALDH的酶活随发酵时间的变化而变化，在整个过程中，ADH的酶活要高于ALDH，最高达到3.3倍，并都于36h达到峰值，分别为8.21U/mg和2.52U/mg。1%～3%（v/v）的乙醇对酶系有诱导作用，在此范围内，ADH和ALDH的水平明显提高，但随着乙醇浓度的增大，对酶活又出现抑制作用。在底酸乙酸存在的发酵条件下，发酵时间缩短，产酸关键酶系酶活水平发生了较大的变化，尤其是ALDH的酶活水平显著提高，最高达到了7.46U/mg。

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