以绿原酸为目标物优化杜仲叶发酵醋的工艺研究

2013-09-03郝建新刘奕炜贾春凤宋陶然戎柯晓张柏林伏帮炳

食品工业科技 2013年3期

郝建新，刘奕炜，杨洋，贾春凤，周方，宋陶然，戎柯晓，张柏林，* ，伏帮炳

(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083;2.林业食品加工与安全北京市重点实验室(北京林业大学)，北京100083;3.略阳绿洲食品有限公司，陕西略阳724300)

杜仲(Eucommiaulmoides)是中国特有的名贵中药，但杜仲常以树皮入药，故树木被剥皮后容易死亡，导致资源破坏严重，需要寻求新的资源利用方式与途径［1］。研究表明，杜仲叶与杜仲皮所含化学成分，特别是有效成分基本一致［2］，但杜仲叶资源却未得到有效地开发和利用。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用［3］。鉴于绿原酸是杜仲叶的有效成分之一，其含量可达1%～5.5%，常作为判断杜仲相关产品的重要指标。《中国药典2010》版采用绿原酸为对照物，以绿原酸含量多寡鉴别中药材料是否为杜仲叶［4］。近年来，关于杜仲叶产品开发有一定的研究［5－9］，但利用绿原酸为评价指标优化杜仲叶发酵醋的工艺尚未见报道。相关数据表明，杜仲叶浸提液经酵母、醋酸菌混合发酵处理，能够有效保持杜仲液中全部的有效成分［10］。本研究以杜仲叶为原料，以其有效成分之一的绿原酸含量为评价指标，辅助与麸皮，开展杜仲叶发酵醋工艺研究，通过评价杜仲叶发酵醋的质量以及体外抗氧化效果，旨在为综合利用杜仲资源，开发新型杜仲醋饮产品提供工艺技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲叶由陕西省略阳县绿洲食品有限公司提供，经自然风干及高速粉碎机粉碎后备用;麸皮由北京良乡面粉厂提供;醋前发酵剂购于上海佳民酿造食品有限公司;醋酸菌AS.14l 购于中国科学院微生物研究所;绿原酸标准品购于北京万诚博达科贸有限公司，为色谱纯;纤维素酶、无水乙醇、乙腈、冰乙酸、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠等购于兰弋试剂公司。

PHS－3C精密型 pH计上海三信仪表厂;MODEL WYT－4型手持糖量仪福建省泉州光学仪器厂;LDZX－40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;MGC－250恒温培养箱上海一恒科技有限公司;SHK－99－Ⅱ台式空气恒温摇床北京北方同正生物技术发展有限公司;SHZ－88型往复式水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂;LC－2010AHT高效液相色谱仪日本岛津仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲叶发酵醋制备

1.2.1.1 杜仲叶预处理根据相关报道［11］，经高速粉碎机粉碎的杜仲叶，按料液比1∶10混合，纤维素酶添加量为杜仲叶干重的0.8%，酶解温度45℃进行预处理，最终酶解时间以释放出的绿原酸确定。绿原酸含量为592.1μg/mL。

1.2.1.2 酒精发酵将预处理后的酶解液换算成相同重量的杜仲叶干重，并添加与中叶干重相同的麸皮，同时调节杜仲叶－麸皮与水的质量体积比为1∶7，按料液体积添加10%的葡萄糖，然后控制料液温度为121℃杀菌30 min。杀菌结束后，物料冷却至室温，按杜仲－麸皮质量接种1%的醋前发酵剂，30℃下发酵，至总糖不再变化时终止酒精发酵，此时酒精度达到9%。

1.2.1.3 醋酸发酵含有1%葡萄糖和1%酵母膏的培养基经121℃灭菌20 min，冷却后加入4%无水乙醇，然后接入保存在斜面培养基上的醋酸菌AS.14l，37℃振荡培养3d后备用。将活化后的醋酸菌AS.14l按14%接种量终止酒精发酵后的杜仲麸皮发酵液中，37℃振荡培养3d，然后静止发酵2d后终止醋酸发酵。

1.2.2 优化杜仲发酵醋工艺基于单因素和正交实验分析，以绿原酸为检测指标，研究了料液比、醋前发酵剂添加量、醋酸菌接种量三个因素对杜仲叶发酵醋中绿原酸含量的影响。

1.2.2.1 单因素分析分别考察了料液比，醋前发酵剂添加量，醋酸菌接种量3个因素单独对杜仲叶发酵醋中的绿原酸含量的影响，并确定各因素较优的水平。

1.2.2.2 工艺参数优化基于单因素影响效果，按表1设计正交实验，考察了料液比、醋前发酵剂添加量以及醋酸菌接种量3个因素对杜仲叶发酵醋中绿原酸含量的综合影响，从而筛选出较优的杜仲叶发酵醋工艺方案(表1)。

表1 基于正交实验分析建立的杜仲叶发酵醋优化工艺Table 1 The optimization of parameters affecting eucommia－vinegar fermentation according to their interaction analysis by orthogonal test

1.2.3 杜仲叶发酵醋成品的理化分析(按国标测定)。

1.2.3.1 总糖测定阿贝折光仪法，总糖表达为%。

1.2.3.2 总酸测定中和滴定法，总酸被表达为g/100mL［12］。

1.2.3.3 卫生指标检测按照GB 2719－1996食醋卫生标准检测。

1.2.3.4 绿原酸含量测定高效液相色谱法［13］。色谱条件:采用迪马 C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈∶水∶冰醋酸(12∶88∶1)为流动相，检测波长325 nm，柱温 30℃，流速 1.0mL/min，进样量5μL。绘制标准曲线:即将20mg绿原酸标准样品用无水乙醇溶解至5mL，然后依次稀释到20、40、60、80、100、120、140μg/mL，每次进样量为 5 μL，按上述色谱条件依次进样测定。以绿原酸质量(μg)为横坐标，以峰面积(mAU)为纵坐标绘制标准曲线。绿原酸含量被表达为μg/mL。

1.2.4 杜仲叶发酵醋的DPPH自由基清除率测定［14］

将绿原酸标准品、醋酸(作为对照)以及杜仲叶发酵醋分别稀释5，10，15，20，25和30倍后检测它们清除DPPH自由基的效果。取绿原酸标准品、醋酸以及杜仲叶发酵醋分别稀释后的溶液1mL，加入0.004%的DPPH乙醇溶液3mL，室温静置30min后517nm处测定吸光值，以无水乙醇为空白调零，阴性对照不加样。DPPH自由基清除率按下式计算:

式中:Ac:1mL无水乙醇中添加3mL DPPH·溶液后的吸光度;Ai:1mL待测液中添加3mL DPPH·溶液后的吸光度;Aj:1mL待测液中添加3mL无水乙醇后的吸光度。

1.2.5 数据分析各实验均重复三次，结果为平均值。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶酶解时间的确定

2.1.1 酶解液中绿原酸的确定 HPLC图谱反映了杜仲叶经酶解预处理后检测到的绿原酸水平(图1)。检测表明，酶解方式允许杜仲叶中的绿原酸(标注峰)大量释放，绿原酸的保留时间是12.095min。图1也说明，与文献中［13］的采取甲醇作为流动相相比，采用乙腈作为流动相，可以使绿原酸的出峰时间提前，检测效率提高。

图1 酶解液中绿原酸液相检测图Fig.1 HPLC of chlorogenic acids released from eucommia leaves enzymatically hydrolyzed

2.1.2 酶解时间的确定图2反映了杜仲叶在料液比1∶10、0.8%纤维素酶添加量以及45℃处理下绿原酸释放量与酶解时间的关系。由图2可以看出，当酶解时间达到2h后，绿原酸含量基本不随酶解时间的延长而增加，此时绿原酸含量为620.9μg/mL。事实上，关于杜仲叶绿原酸酶解时间的确定，因料液比、酶添加量、酶的种类、pH等处理因素不同会引起绿原酸释放时酶解时间不同，因而酶解适宜时间需要通过具体实验条件来确定［15］。

图2 酶解液中绿原酸的释放Fig.2 The level of chlorogenic acids released from hydrolyzed eucommia leaves

2.2 影响杜仲发酵醋工艺的因素

2.2.1 杜仲叶发酵醋中绿原酸检测杜仲叶发酵醋中绿原酸的定性检测见图3。由图3可以看出，杜仲叶经发酵成为醋饮后，绿原酸(标注峰)仍能维持在一定的水平，说明酒精发酵和醋酸发酵过程不会对绿原酸含量产生显著影响，这与相关报道相符［10］。其次，与图1酶解液中绿原酸定性检测相比较，绿原酸的出峰时间基本没有改变，说明发酵过程或许不会影响绿原酸的结构。

图3 发酵醋中绿原酸的液相检测Fig.3 Chlorogenic acids of fermented eucommia leaves vinegar detected by HPLC

2.2.2 料液比对杜仲叶发酵醋绿原酸含量的影响将杜仲叶和麸皮的比例、醋前发酵剂添加量及醋酸菌接种量分别设为1∶1、10%和10%，对料液比(杜仲叶－麸皮和水的质量比例)影响绿原酸含量的研究表明，在其它因素不变的条件下，随着料液比增大，绿原酸释放量有降低的趋势，料液比不同，醋酸发酵结束时杜仲醋饮中的绿原酸含量不同，料液比越小，杜仲醋饮中绿原酸含量越大。显然，本研究设计的最小料液比不会影响绿原酸的释放，在满足其他条件下，料液比宜取1∶6为好，但是实际情况料液比为1∶6时醋的产率太低，综合考虑料液比宜取1∶7。(图4)。

图4 料液比的影响Fig.4 Effect of the solid－liquid ratio on the release of chlorogenic acids in fermented eucommia leaves vinegar

2.2.3 醋前发酵剂添加量对杜仲叶发酵醋绿原酸含量的影响将杜仲叶和麸皮的比例、料液比和醋酸菌接种量分别设为1∶1、1∶10和10%，研究了醋前发酵剂添加量(醋前发酵剂占杜仲叶－麸皮质量的比重)对绿原酸含量的影响表明，增大醋前发酵剂添加量，杜仲叶醋饮中的绿原酸含量反而下降，说明醋前发酵剂会抑制发酵过程中绿原酸的释放，并且在一定醋前发酵剂添加量范围内抑制作用较为明显，这种抑制机理尚不明确，需要进一步研究。因此，在酒精度达到醋酸发酵前提下，醋前发酵剂的添加量宜取2%(图5)。

2.2.4 醋酸菌接种量对杜仲叶发酵醋绿原酸含量的影响将杜仲叶和麸皮的比例、料液比、醋前发酵剂添加量分别设为1∶1、1∶10和10%，研究了醋酸菌接种量(液态菌种占发酵液体积的比重)对绿原酸含量的影响表明，随着醋酸菌接种量的增大，绿原酸含量增加，当醋酸菌接种量超过12%时，绿原酸含量的增加趋势变缓。所以，在一定范围内，增加醋酸菌接种量有助于绿原酸的释放，本研究取醋酸菌接种量为

12%(图6)。

图5 醋前发酵剂的添加量的影响Fig.5 Effect of the addition of pre－cultures on the release of chlorogenic acids in fermented eucommia leaves vinegar

图6 醋酸菌接种量的影响Fig.6 Effect of the inoculum of strain AS.14l on the release of chlorogenic acids in fermented eucommia leaves vinegar

2.2.5 杜仲叶发酵醋工艺优化参数上述单因素分析结果表明，料液比、醋前发酵剂添加量以及醋酸菌接种量均会影响最终杜仲叶发酵醋饮中的绿原酸释放水平，显然，这3个因素的不同组合水平所释放出的绿原酸含量是有差异的。为此，我们进一步考察了这3个因素影响杜仲叶发酵醋饮中绿原酸含量的交互作用，以构建优化的杜仲叶发酵醋工艺参数。基于绿原酸水平，表2是综合了各因素不同水平的杜仲叶发酵醋饮筛选工艺方案的结果。根据正交实验中的极差R排序分析，影响杜仲叶发酵醋中绿原酸含量程度的各因素顺序依次为醋前发酵剂添加量＞料液比＞醋酸菌接种量。结合正交实验中的K值，可以确定各影响因素的最佳组合为A1B1C2，即杜仲麸皮发酵醋的优化工艺条件为物料比1∶7，醋前发酵剂添加量1%，醋酸菌接种量14%。鉴于优化杜仲发酵醋饮工艺参数不属于所设定的16组实验内，因此需要进行验证实验。基于上述各因素最佳组合条件，获得杜仲叶发酵醋中的绿原酸含量为131.1μg/mL，结合表2数据可知，优化组合工艺显著提高了杜仲叶发酵醋中的绿原酸水平，证实优化工艺参数可行。

2.3 杜仲叶发酵醋工艺的建立

本文以绿原酸为目标物，基于杜仲叶酶解液中绿原酸释放条件，结合杜仲叶发酵醋饮优化发酵工艺参数，建立了一种新的杜仲叶发酵醋饮工艺流程(图7)。该醋饮工艺包含三个主要工艺技术:一是杜仲叶酶解处理，二是杜仲叶部分替代麸皮的酒精发酵及醋酸发酵，由杜仲叶预处理、酶解、杀菌、酒精发酵、醋酸发酵、巴氏杀菌、离心去沉淀和成品8个步骤完成。在此基础上，制备出的杜仲叶发酵醋饮产品中绿原酸含量为131.1μg/mL。

图7 工艺流程图Fig.7 Technological flow sheet

表2 优化杜仲叶发酵醋工艺参数的正交实验结果Table 2 Parameters for the optimized fermentationof eucommia leaves vinegar according to orthogonal test

2.3.1 杜仲叶发酵醋成品质量分析按优化工艺得到的杜仲叶发酵醋成品经检测获得各项理化指标，与国家酿造食醋(GB18187－2000)标准比对结果列于表3。由表3可以看出，杜仲叶发酵醋，无论在感官指标，还是理化以及卫生指标方面，都能很好的满足国标要求，且成品中的绿原酸含量较高。

2.3.2 杜仲叶发酵醋的DPPH自由基清除率鉴于杜仲绿原酸的强烈抗氧化效果，本研究对基于上述工艺获得的杜仲叶发酵醋的体外抗氧化能力进行了评价(图8)。通过与相同浓度的绿原酸或者与相同浓度的纯醋酸相比，图8反映了杜仲叶发酵醋在不同稀释倍数下的DPPH自由基清除能力，可以看出，

尽管杜仲叶发酵醋与绿原酸纯品的DPPH自由基清除能力都较强，但随着稀释倍数的上升，与纯品绿原酸对照，杜仲叶发酵醋的DPPH自由基清除能力随着稀释倍数的增加降低比较慢，稀释后其自由基的清除效果较绿原酸纯品的效果要好。与纯醋酸的DPPH自由基清除能力20.98%相比，则在稀释25倍后，杜仲叶发酵醋的 DPPH自由基清除能力为69.31%。显然，杜仲叶发酵醋有较强的体外抗氧化效果，其中当绿原酸与醋酸叠加后大大提高了杜仲叶发酵醋的体外抗氧化能力。

表3 发酵醋理化指标与国标对比Table 3 Comparisons of the properties of the fermented eucommia leaves vinegar product with the edible vinegar according to national standard

图8 DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH·scavenging activity

3 结论

3.1 制备杜仲叶发酵醋包括三个环节，即杜仲叶酶解预处理、酒精发酵及醋酸发酵。酶解时间是影响杜仲叶中绿原酸释放的主要因素，而杜仲叶酶解后的料液比、醋前发酵剂添加量及醋酸菌接种量是最终获得杜仲叶发酵醋的关键因素，本研究优化了杜仲叶发酵醋工艺参数，其中酶解:料液比1∶10、纤维素酶添加量0.8%、温度45℃、时间2h;酒精发酵:杜仲叶－麸皮与水的质量体积比为1∶7，葡萄糖添加量为发酵液体积的10%、醋前发酵剂添加量为杜仲叶－麸皮质量的1%;醋酸发酵:醋酸菌接种量为发酵液体积的14%。构建了杜仲叶酶解后辅以麸皮发酵醋的工艺方式，按此工艺制备的杜仲叶发酵醋产品符合国标要求，且绿原酸含量较高，表现出较好的体外抗氧化效果。

3.2 本研究证实，来自杜仲叶中的绿原酸含量在发酵醋加工过程含量变化不大，可以用绿原酸含量作为指标筛选杜仲叶发酵醋的工艺参数。

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