人CD96第一个IgV结构域的表达、结晶及晶体学分析

姜文婧，张水军，严景华，郭宁

1 安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 2300362 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101

人CD96第一个IgV结构域的表达、结晶及晶体学分析

姜文婧1,2，张水军2，严景华2，郭宁1

1 安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036
2 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101

姜文婧, 张水军, 严景华, 等. 人CD96第一个IgV结构域的表达、结晶及晶体学分析. 生物工程学报, 2013, 29(5): 657−663.

Jiang WJ, Zhang SJ, Yan JH, et al. Expression, crystallization and crystallographic study of the 1stIgV domain of human CD96. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 657−663.

CD96 (Tactile) 是一个主要表达在活化的T细胞、NK细胞上的免疫受体分子。它属于免疫球蛋白超家族，胞外区有3个免疫球蛋白结构域 (V1，V2/C和C)。最近的研究表明，CD96的第一个IgV结构域 (CD96V1)在细胞粘附和 NK细胞介导的杀伤过程中起着重要的作用。文中构建了人类 CD96第一个 IgV样结构域(hCD96V1) 的表达载体，并将它在大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株中以包涵体形式表达。通过包涵体体外复性，得到了CD96可溶性蛋白。分析超速离心结果证明CD96可溶蛋白在体外以二聚体形式存在。采用座滴气相扩散法获得了衍射质量较好的CD96蛋白晶体，衍射分辨率为1.9Å，晶体属于空间群P21，晶胞参数为a=35.1，B=69.5，C=49.6Å，α=γ=90°，β=105.4°。CD96晶体及衍射数据的获得为后续的结构和功能研究奠定了基础。

CD96，第一IgV结构域，细胞粘附分子，蛋白纯化，结晶

NK细胞是天然免疫 (Innnate immunity) 中一类十分重要的淋巴细胞[1-2]，在抗肿瘤和抗病毒免疫反应中起着重要的作用[3-4]。NK细胞上表达一类受体分子，可以识别靶细胞上表达的Nectins/Necls (Nectin like molecules) 家族分子[5]。这类受体包括CRTAM、CD96、CD226、tigit等。Nectin/Necls家族共有9个分子，分别是Nectin 1、Nectin 2、Nectin 3、Nectin 4、Necl 1、Necl 2、Necl 3、Necl 4及Necl 5[6]。这类受体与配体的相互作用介导NK细胞与靶细胞的粘附，促进或者抑制NK细胞的激活[6-8]。CD96属于免疫球蛋白超家族，最初被确定为一个新的人类T细胞激活型抗原[9]。NK细胞和 T细胞经活化后，CD96的表达会明显上调[10-11]。脊髓灰质炎病毒受体(PVR，CD155，Necl5) 是目前人体中唯一确定的与CD96相互作用的分子[12-13]。CD96与CD155相互作用介导细胞粘附，促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤[14]。此外，CD96还被作为许多急性髓细胞性白血病的干细胞表面标志物 (AML-LSCS)[15]。荧光激活细胞分选 (FACS) 分析表明，CD96在CD34+，CD38−AML 细胞中有大量表达[16]。

人的CD96分子在转录后经选择性剪接形成两个剪接体 (剪接体1和2)[9]。人CD96剪接体1的胞外有568个氨基酸，包含3个连续免疫球蛋白 (Ig) 结构域 (V1，V2和 C)。它在邻近跨膜区有一段富含丝氨酸/苏氨酸/脯氨酸的柔性颈部区。该柔性颈部区高度糖基化。剪接体2由于在第2个Ig结构域缺少外显子4编码的16个氨基酸，形成了C型或Ⅰ型Ig结构域。它是CD96的主要表达形式[13]。人类CD96免疫球蛋白第1个IgV结构域 (hCD96V1) 的N-端包含108个氨基酸 (残基29-137)。Meyer等进行的一项研究表明主要是 CD96第 1个 IgV结构域参与了同CD155的结合[13]。

因此，对CD96第1个IgV结构域的研究可以为靶细胞和活化的免疫细胞 (T细胞或NK细胞) 相互作用提供结构依据。本研究在大肠杆菌中以包涵体形式成功表达了人CD96第1个IgV结构域 (hCD96V1)，并将其在体外复性。复性后的蛋白经凝胶过滤和阴离子交换层析纯化后用于晶体生长。我们采用座滴气相扩散法得到了CD96晶体，衍射分辨率为1.9Å，为后续结构解析奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 pET21a-hCD96V1表达质粒的构建

1.1.1 引物设计

目的片段为人类CD96 (GenBank Accession No. NM_005816) 第1个Ig V样结构域 (残基29-137)，选择适当的酶切位点，并设计引物(表 1) 扩增目的基因片段，用双酶切 (XhoⅠ，Nde) Ⅰ过夜酶切目的载体 (pET21a) 和目的片段，琼脂糖凝胶电泳切胶回收后，直接进行连接、转化，挑取克隆，通过菌液 PCR及酶切鉴定，并送测序。

表1 引物设计Table 1 Primers used in this study

1.2 hCD96V1的小量表达分析

将测序正确的阳性重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株 BL21(DE3) 感受态细胞中，挑取单菌落接种到含终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃恒温培养。当菌体密度(OD600) 达到约0.6时，加入终浓度1 mmol/L的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG，Sigma公司) 诱导蛋白表达，37 ℃培养4 h后收集细胞并检测目的蛋白表达情形。

1.3 hCD96V1的复性和分离纯化及分析超速离心

将hCD96V1结构域大量表达，采用透析复性的方式[17]进行蛋白结构域的复性，复性缓冲液(4 mol/L尿素，100 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，400 mmol/L L-精氨酸，1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，5 mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 8.0)；通过superdex75 10/300 GL柱 (GE Healthcare)和阴离子交换柱 resource Q进一步纯化复性后的蛋白，旨在得到一定浓度和纯度的hCD96V1蛋白。

将制备好的蛋白浓缩 (蛋白浓度在A280=1.0 AU)，缓冲体系为 20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0。将测定样品和空白对照(20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)各取400 μL于离心机 (Beckman Coulter An-60)的比色杯中。转动速度设置为54 000 r/min，每隔480 s测定紫外光的吸收谱，并用软件计算沉降速率。

1.4 hCD96V1蛋白结晶、衍射、数据分析

将纯化的 hCD96V1蛋白浓缩至一定体积后，使用Hampton research公司的Index试剂盒或其他试剂盒进行蛋白结晶条件的初筛，1 μL蛋白与1 μL池液混合，并在200 μL池液的环境下采用291 K座滴气相扩散法尝试结晶。得到良好的初筛结果后，将条件优化，旨在得到衍射分辨率较高的晶体，进行蛋白晶体的衍射和结构的解析。数据收集时，hCD96V1蛋白单晶首先转移到晶体防冻液中 (17%甘油，17%的 H2O和66%的池液) 浸泡30 s，迅速取出置于X-光下，于100 K收集数据。晶体衍射数据的收集在上海同步辐射 (SSRF)，光束线 BL17U1完成。衍射数据的处理通过HKL2000完成。

2 结果与分析

2.1 pET21a-hCD96V1表达质粒构建

hCD96V1基因的PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳纯化后，在 300 bp处可见特异性条带，与理论大小一致 (图 1A)。进一步连接到pET21a(+) 载体中，双酶切鉴定结果如图 1B所示。

图 1 hCD96v1的 PCR 产物鉴定 (A) 和pET21a-hCD96V1质粒的双酶切鉴定 (B)Fig. 1 PCR product of hCD96V1 gene fragment (A)and identification of the pET21a-hCD96V1 plasmid by enzyme digestion. (A) M: DL2 000 DNA marker; 1:PCR product (B) M: DNA marker. 1: pET21a-hCD96V digested with Xho I/Nde I.

2.2 hCD96V1的表达鉴定

将测序正确 pET21a-hCD96V1质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单克隆并进行蛋白的诱导表达，37 ℃恒温培养4 h后，收集细菌并使用裂解液和超声先后进行化学和物理裂解，将裂解后的菌液离心，并分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE电泳分析 (分离胶浓度为15%)。结果显示 (图2)，含CD96 V1沉淀样品在分子量约为11 kDa处出现一条明显的蛋白带，而在未诱导对照组和上清样对照组中均未出现此条带，说明CD96 V1结构域在原核细胞中是可诱导表达的，并且主要以包涵体形式表达。

2.3 CD96 V1结构域的蛋白纯化及分析超速离心

图2 SDS-PAGE鉴定CD96V1的诱导表达Fig. 2 SDS-PAGE analysis of CD96V1 expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). 1: standard protein marker; 2: a single colony was picked and incubated in Luria-Bertani (LB) medium containing 100 μg/mL ampicillin at 310 K for 4 hours without adding isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG; Sigma, USA); 3:when the culture density (OD600) reached about 0.6,1 mmol/L IPTG was added to the culture and the cells were induced at 310 K for 4 h. Proteins of CD96V1 were expressed as inclusion bodies.

通过大规模培养大肠杆菌并使其诱导表达目的蛋白，提取包涵体。随后利用透析复性的方法对包涵体进行复性，并进一步通过分子筛纯化，hCD96V1出峰位置在12.33 mL，分子量大约为24 kDa，hCD96V1单体分子量约为12 kDa(图 3)，收集主峰位置的蛋白，进一步用阴离子交换层析方法获得了高纯度且均一的可溶性hCD96V1蛋白。分析超速离心的结果说明hCD96V1在溶液中大多数以二聚体的形式存在，并含有少量的四聚体 (图4)。

2.4 hCD96V1蛋白的结晶

将 hCD96V1蛋白样品浓缩至浓度为5～10 mg/mL (缓冲液体系为：20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl)。采用座滴气相扩散法在18 ℃恒温条件下进行结晶条件初筛，在Hampton Research公司的Index Kit 92号条件获得晶体 (图5) (结晶条件为0.1 mol/L甲酸镁水合物，15% (W/V) 聚乙二醇3 350)。衍射分辨率为1.9Å (图6)。晶体衍射数据集统计汇总于表2。晶体空间群为P21，晶胞参数为 a=35.1，B=69.5，C=49.6Å，β=105.4°。

图3 hCD96V1结构域的蛋白纯化Fig. 3 Gel-filtration profile of refolded hCD96V1 by Superdex 75 10/300 GL column (column volume:24 mL; GE Healthcare). The elution volume is about 12.33 mL. The inserted figure is a migration profile of the purified protein on a reduced SDS-PAGE gel (15%).The molecular weight markers (Lane M) are in indicated.

图4 hCD96V1结构域的蛋白分析超速离心结果Fig. 4 The analytical ultracentrifugation result of the first domain of human CD96. The majority of CD96 V1 forms dimer with approximate molecular weight of 26.9 kDa. A small percentage of CD96 also forms tetramer with approximate molecular weight of 51.8 kDa.

研究发现CD96广泛表达于各种组织中[18]，并且可能具有多种生物学作用[18]，但目前的研究主要集中在它在NK细胞杀伤中的作用，以及它可以作为急性髓细胞性白血病的干细胞的marker，其他的功能有待进一步研究。a

图5 hCD96V1结构域的蛋白晶体Fig. 5 Crystals of the hCD96V.

图6 hCD96V1结构域蛋白晶体衍射图Fig. 6 X-ray diffraction image of the human CD96 1st V-domain crystal.

表2 衍射数据Table 2 Data collection statistics

我们用BLAST将CD96与已知蛋白序列进行同源比对，发现与CD96分子同源性较高的蛋白分子有 CD86、CD113、CD166 和 CD226 等[19]。而研究表明这些分子均具有一定的介导细胞粘附功能[20]。其中同源性最高的为CD226，已有的研究表明 CD226与 CD96识别共同的配体CD155[18,21]，介导NK和T细胞活化和杀伤[22]。CD96和 CD226的同源性主要在胞膜外 N-端的第一Ig样结构域，同源性29%，推测二者的D1可能采用相似的方式与配体识别和结合。除此之外，与CD96的第一蛋白结构域同源性较高的是Nectin-1的第 1蛋白结构域 (V-set)，但也仅为23%。而其他已知结构的免疫球蛋白分子与人类CD96的同源性更低，因此用分子置换法解析hCD96V1的结构尚有难度。我们尝试用硒代等方法解析其结构，但未能成功。

尽管结构仍然没有解析，然而hCD96V1蛋白的复性成功对于进一步解析CD96结构、CD96与其配体CD155复合体结构奠定了基础。hCD96与其配体相互作用模式对于NK细胞免疫调节机制的研究具有重要参考价值。

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November 23, 2012; Accepted: January 8, 2013

Ning Guo. Tel/Fax: +86-551-65786216; E-mail: guoning-guo@yahoo.com.cn

国家自然科学基金 (No. 31030030) 资助。

Expression, crystallization and crystallographic study of the 1stIgV domain of human CD96

Wenjing Jiang1,2, Shuijun Zhang2, Jinghua Yan2, and Ning Guo1

1School of Life Science,Anhui Agricultural University,Hefei230036,Anhui,China
2CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

CD96 (Tactile) is an adhesion receptor expressed mainly on activated T cells, NK cells. As a family member of the immunoglobulin-like cell receptor, CD96 consists of three immunoglobulin-like domains (V1, V2/C and C) in the extracellular region. Recent studies have shown that the 1stIgV domain of CD96 (CD96V1) plays an essential role in cell adhesion and NK cell-mediated killing. In this study, the 1stIgV domain of human CD96 (hCD96V1) was cloned and expressed inEscherichia coli(BL21). The soluble protein was obtained by refolding of the hCD96V1 inclusion bodies.From analytical ultracentrifugation, we could predict that CD96 V1 maily exists as dimer with approximate molecular weight of 26.9 kDa. The protein was then successfully crystallized using the sitting-drop vapour-diffusion method. The crystals diffracted to 1.9 Å resolution and belonged to space groupP21, with unit-cell parametersa=35.1,b=69.5,c= 49.6Å,α=γ=90°, β=105.4°.

CD96, 1stV domain, cell adhesion molecules, protein purification, crystallization

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31030030).

(本文责编 郝丽芳)