利用人工锌指文库选育高乙醇耐受性工业酵母菌株

马翠，赵心清，李倩，张明明，Jin Soo Kim，白凤武

1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 1160242 ToolGen, Inc, Seoul, 153-023, South Korea

利用人工锌指文库选育高乙醇耐受性工业酵母菌株

马翠1，赵心清1，李倩1，张明明1，Jin Soo Kim2，白凤武1

1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024
2 ToolGen, Inc, Seoul, 153-023, South Korea

马翠, 赵心清, 李倩, 等. 利用人工锌指文库选育高乙醇耐受性工业酵母菌株. 生物工程学报, 2013, 29(5): 612−619.

Ma C, Zhao XQ, Li Q, et al. Breeding of robust industrial ethanol tolerantSaccharomyces cerevisiaestrain using artificial zinc finger protein library. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 612−619.

选育高乙醇耐性的酿酒酵母菌株对提高燃料乙醇的发酵效率具有重要意义。锌指蛋白广泛存在于多种生物中，对基因的转录和翻译起重要的调节作用。利用人工设计的锌指蛋白可定向设计锌指序列及其排列顺序，实现对细胞内多个基因的全局调控。由于与环境胁迫反应相关的基因很多，因此可利用人工锌指蛋白技术获得耐受性提高的微生物重组菌。文中将人工锌指文库转入到酿酒酵母模式菌株S288c，选育了具有高乙醇耐受性的重组菌株M01，并分离了与乙醇耐受性提高相关的人工锌指蛋白表达载体pRS316ZFP-M01，转入工业酿酒酵母Sc4126，在含有不同浓度乙醇的平板上，工业酵母Sc4126的重组菌株表现出显著的耐受性提高。在高糖培养基 (250 g/L) 条件下进行乙醇发酵，发现重组菌的乙醇发酵效率明显快于野生型，发酵时间提前24 h，且发酵终点乙醇浓度提高6.3%。结果表明人工锌指文库能够提高酵母的乙醇耐受性，为构建发酵性能优良的酵母菌种奠定了基础。

酿酒酵母，人工锌指蛋白，乙醇耐受性，乙醇发酵

利用可再生生物质资源生产生物燃料，是解决我国能源短缺问题的重要途径，但目前生物燃料的生产效率还有待提高。发酵终产物乙醇浓度偏低，导致后续精馏能耗过高，是影响燃料乙醇工业化生产的一个关键因素。此外，原料水解过程中产生的多种抑制物 (如乙酸、糠醛等) 对细胞生长和发酵的抑制，也是影响发酵效率的主要因素[1-2]。选育对高浓度乙醇和乙酸等抑制物具有较好耐受性的工业酵母菌株，可提高菌种的细胞活性和发酵性能，因此近年来引起了普遍的关注[3-6]。

影响酵母菌乙醇耐受性的基因有很多[7-9]，如热休克蛋白和海藻糖合成相关基因，细胞能量代谢相关基因，氨基酸合成及转运相关基因，细胞壁及细胞质膜成分合成基因，以及糖转运蛋白基因等。利用关键途径的代谢工程改造与全基因组重组技术相结合的手段，成功构建了胁迫耐性和发酵效率均提高的基因工程菌株，提高了工业酿酒酵母的逆境抗性和发酵性能[10-11]，但由于胁迫耐受性受多基因控制，目前提高酿酒酵母乙醇耐受性的有效方法是通过基因组改组 (Genome shuffling)，全局转录工程 (Global transcription machine engineering，gTME) 等基因组工程改造手段，以实现对相关基因的全局调控[6,12-14]。

锌是影响酵母细胞生长和代谢的重要金属元素，除了作为辅酶影响酶活性，锌还可结合多种蛋白和核酸，并对其结构的维持和调节功能具有重要作用[15]。锌指蛋白是含锌蛋白质中最常见的一种，在转录和翻译过程中起到至关重要的作用，可调控多种重要的细胞代谢途径。生物信息分析表明，酿酒酵母基因组中含有 31个锌指蛋白，其中一些锌指蛋白，如MSN2、MSN4、CRZ1等对乙醇耐性具有调节作用[16-17]，但很多其他锌指蛋白的功能还不清楚。利用人工合成的锌指蛋白在细胞中表达，可实现对细胞中多个基因的同时调控，从而实现对代谢的多效调节[18-20]。已证明人工锌指蛋白基因在酵母中的表达可提高酵母菌的耐药性[19]，但人工锌指蛋白在工业酿酒酵母菌株选育中的应用还没有报道。

本文将人工锌指蛋白基因文库转化到酿酒酵母模式酵母S288c中，成功选育了乙醇耐性提高的重组菌M01，并进一步获得了乙醇耐性和高糖发酵性能提高的工业酵母重组菌。

1 材料与方法

1.1 微生物菌种和培养基

大肠杆菌DH5α，酿酒酵母模式菌株S288c，以及乙醇工业酵母Sc4126，本实验室保存。

YPD培养基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10；LB培养基 (g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10；种子培养基 (g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉4，蛋白胨3；发酵培养基 (g/L)：葡萄糖250，酵母浸粉12，蛋白胨10。

大肠杆菌转化子培养加入氨苄青霉素，终浓度为100 μg/mL，酵母菌转化子的筛选利用G418，终浓度为 200 μg/mL (S288c 宿主) 或 300 μg/mL(Sc4126 宿主)。

1.2 方法

1.2.1 人工锌指文库的转化与乙醇耐性提高的重组菌的获得

人工锌指基因文库由韩国 ToolGen公司提供[19]。为筛选乙醇耐性提高的重组菌株，实验首先确定了出发菌株 S288c在 20%乙醇冲击时细胞活性的变化，在含有20%乙醇的YPD液体培养基中接种S288c，30 ℃、150 r/min摇床培养，在2 h、3 h、4 h时分别取样，涂布于YPD固体培养基中培养24 h，确定使菌体全部死亡的最短冲击时间。若重组菌株在同样冲击条件下可以存活，说明其乙醇耐受性提高，这样可以使更多耐性提高的重组菌得到富集，达到初步筛选的目的。接着对转化子进行进一步筛选，将转化子用含有20%乙醇的YPD液体培养基中，150 r/min、30 ℃处理3 h，然后涂布于含有10%乙醇的YPD固体培养基中，30 ℃培养。为筛选耐性较强的转化子，将各转化子在YPD液体培养基中，30 ℃、150 r/min摇床培养12 h后，取菌液进行点板实验，在乙醇终浓度为0%、6%、8%、10% (V/V)的YPD固体培养基上，30 ℃培养，从而筛选得到乙醇耐性提高的酿酒酵母重组菌M01，耐性实验至少重复3次。

1.2.2 人工锌指蛋白的序列分析及功能验证

按照参考文献[21]所示的方法提取重组菌M01中的质粒 DNA，并转化大肠杆菌，提取含有人工锌指蛋白的载体 pRS316ZFP-M01。同时以其作为模板，利用设计的引物 Zinc-4-F2(5¢-CACCAAGTGTAAGCCTATCCCTGAC-3¢) 和Zinc-4-R2 (5¢-GCGGACCTCTGAGTTGATGCTG TAA-3¢) 扩增人工锌指蛋白基因片段，并进行测序分析 (Invitrogen，上海)。人工锌指蛋白基因序列已提交GenBank (Accession No. JX982113)。

1.2.3 相关人工锌指蛋白对工业酵母的乙醇耐受性的影响

采用电转化方法，将pRS316ZFP-M01载体转入工业酵母Sc4126，利用1.2.1中的点板方法比较转化子与野生型菌株之间的乙醇耐受性差异。实验重复3次，得到可重复性的结果。

1.2.4 工业酵母转化子乙醇发酵性能研究

利用 Sc4126重组菌株和野生型菌株进行高糖发酵，分别接种到装有 50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃培养16 h。然后以10%的接种量接种到装有 100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，150 r/min、30 ℃发酵。每隔12 h取样测定菌体浓度 (OD620) 和残糖含量，待残糖含量低于20 g/L时改为每6 h取样，然后离心取上清液，稀释适当倍数后按参考文献方法测量还原糖和乙醇的含量[22]。发酵实验重复3次，得到一致的结果。

2 结果与分析

2.1 以酿酒酵母 S288c为宿主的高乙醇耐性重组菌的筛选

本实验室前期将人工锌指蛋白文库直接转化工业酵母4126，在20 000个转化子中获得了约200个乙醇耐性提高的重组菌株，但乙醇发酵性能与野生型相比没有明显提高，而且在不含高浓度乙醇的平板上，重组菌生长速率明显弱于野生型。因此选择对乙醇敏感的模式酵母S288c作为宿主进行研究。结果表明，在20%高浓度乙醇冲击后，筛选得到耐性可能提高的转化子，选取长势较快的4株转化子进一步比较，结果见图1。在不含乙醇的平板上，重组菌已经表现出了比较强的生长优势，而在含有 6%～10%的乙醇平板上，重组菌的生长优势更加明显 (图1)。

2.2 与乙醇耐受性提高相关的人工锌指蛋白序列分析

挑取耐性提高的 4号酵母重组菌 (命名为M01) 提取载体，获得了含有人工锌指蛋白的表达载体 pRS316ZFP-M01。利用该载体为模板，扩增出含有锌指蛋白基因的目标片段，氨基酸序列分析结果表明，耐性提高的重组菌中锌指蛋白是四锌指蛋白，均为Cys2His2 型锌指，其中含有4个CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H (X代表任意氨基酸) 型基序，分别为Zinc 1、2、3、4 (图2)。通过序列比对发现，pRS316ZFP-M01中编码锌指基序的序列分别与已知的锌指蛋白基因ZNF189、FAM92A1、GRCH37和ZNF314的锌指基序相似[23]，但这些锌指基序在工业酵母中识别和控制的基因，以及从而导致的调控机理还不清楚，目前我们正在对人工锌指蛋白的作用机理进行进一步的研究。

图1 酿酒酵母S288c的高乙醇耐性重组菌的筛选Fig. 1 Screening of ethanol tolerant recombinant strains of S288c.

图2 人工锌指蛋白氨基酸序列分析Fig. 2 Analysis of amino acid sequences of the artificial zinc finger protein.

2.3 工业酵母中人工锌指蛋白作用的比较

2.3.1 固体培养基上转化子与野生型之间的耐受性差异

将pRS316ZFP-M01转入乙醇发酵性能较好的工业酵母 Sc4126中，得到的转化子 Sc4126z在含有0%、8%、10% (V/V) 的乙醇和5 g/L乙酸的固体平板上进行生长比较，结果见图3。可以看出Sc4126的转化子在10%乙醇的胁迫下耐性明显提高，在5 g/L乙酸的平板上也可以表现出细胞生长明显好于野生型菌株，这说明人工锌指基因确实可以提高酵母菌对多种环境胁迫因素的耐受性。但将该载体转化另外一株工业酵母菌Sc6525，获得的转化子耐性并未得到改善 (结果未显示)，表明耐受性的改变与酵母菌的遗传背景有关。类似的现象在韩国学者利用同样的人工锌指蛋白基因文库进行癌细胞研究时也发现过[24]，作者将人工锌指蛋白基因F2840-p65同时转入293细胞和Hela细胞中，并进行基因芯片分析，发现该基因虽然在两种细胞中可调控一些类似的基因群的表达，但一些基因的调控方式在两个细胞中也存在差异，推测染色质的结构以及DNA含量的不同可能是导致差异的原因。

2.3.2 转化子的高糖发酵结果

由于在固体培养基上 Sc4126的重组菌Sc4126z与野生型相比，乙醇耐性表现出了明显提高，因此选择该重组菌进行高糖乙醇发酵实验，结果见图4。由图4A可以看出，在相同接种量的情况下，重组菌与野生型生长趋势基本一致，重组菌株生长略好于野生型。由图4B中可以看出，与野生型相比，重组菌的最终乙醇产量为 85.28 g/L，而野生型的最终乙醇产量为80.19 g/L，重组菌比野生型的乙醇产量高6.3%；培养基中残糖的变化，两个菌株也表现出显著差异，在发酵进行60 h后，重组菌培养基中的葡萄糖基本完全消耗，而此时野生型培养基中的残糖量高达23.19 g/L，即使延长发酵时间残糖也无法完全消耗 (图4B)。

图3 含人工锌指蛋白的工业酵母Sc4126重组菌环境胁迫耐受性提高Fig. 3 Stress tolerance was improved by artificial zinc finger protein in industrial yeast strain Sc4126. Upper panel: Sc4126; lower panel: Sc4126z.

图4 高糖发酵中菌体浓度 (A)、乙醇和还原糖浓度的变化 (B)Fig. 4 Cell growth (A), ethanol production and glucose consumption (B) of the yeast strains under high concentration substrate condition.

目前对人工锌指蛋白作用机理的研究还不够深入。人工锌指蛋白可结合基因组上多个DNA位点，这些位点通常是基因的启动子区域，同一锌指蛋白可同时上调某些基因的表达和抑制某些基因的表达，从而实现对基因组全局水平的调控[23]。本实验室近期的研究发现，锌对酿酒酵母乙醇发酵过程中乙醇耐受性和乙酸、高温等耐受性都具有保护作用[22,25]，但这种保护作用是否与锌指蛋白参与的调控相关还不清楚，目前正在进行深入的机理研究，从而寻找可能的提高乙醇耐性的目标基因，进行进一步理性的代谢工程改造。本文的结果表明，利用人工锌指蛋白可提高酿酒酵母的乙醇耐性，获得高乙醇耐性的工业酵母重组菌。对耐性提高的工业酵母重组菌进行进一步的分析，将揭示人工锌指蛋白对细胞代谢的调控机制，为定向改造工业酵母菌株，提高燃料乙醇的生产效率奠定基础。

[1]Zhang SS, Huang RB, Zhou X, et al. Advances in research on the mechanisms ofSaccharomyces cerevisiaeethanol tolerance. China Microbiol,2009, 36(10): 1604−1608 (in Chinese).

张穗生, 黄日波, 周兴, 等. 酿酒酵母乙醇耐受性机理研究进展. 微生物学通报, 2009, 36(10):1604−1608.

[2]Li HX, Zhang XR, Shen Y, et al. Inhibitors and their effects onSaccharomyces cerevisiaeand relevant countermeasures in bioprocess of ethanol production from lignocellulose-a review. Chin J Biotech, 2009, 25(9): 1321−1328 (in Chinese).

李洪兴, 张笑然, 沈煜, 等. 纤维素乙醇生物加工过程中的抑制物对酿酒酵母的影响及应对措施. 生物工程学报, 2009, 25(9): 1321−1328.

[3]Tao XL, Zheng DQ, Liu TZ, et al. A novel strategy to construct yeastSaccharomyces cerevisiaestrains for very high gravity fermentation. PLoS ONE,2012, 7(2): 31−35.

[4]Zheng DQ, Wu XC, Tao XL, et al. Screening and construction ofSaccharomyces cerevisiaestrains with improved multi-tolerance and bioethanol fermentation performance. Bioresour Technol,2011, 102(3): 3020−3027.

[5]Zhang JG, Liu XY, He XP, et al. Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance ofSaccharomyces cerevisiaeby disruption of the FPS1 aquaglyceroporin gene. Biotechnol Lett,2011, 33(2): 277−284.

[6]Shi DJ, Wang CL, Wang KM. Genome shuffling to improve thermotolerance, ethanol tolerance and ethanol productivity ofSaccharomyces cerevisiae.J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(1): 139−147.

[7]Zhang QM, Zhao XQ, Jiang RJ, et al. Ethanol tolerance in yeast: molecular mechanisms and genetic engineering. Chin J Biotech, 2009, 25(4):481−487 (in Chinese).

张秋美, 赵心清, 姜如娇, 等. 酿酒酵母乙醇耐性的分子机制及基因工程改造. 生物工程学报,2009, 25(4): 481−487.

[8]Hirasawa T, Yoshikawa K, Nakakura Y, et al.Identification of target genes conferring ethanol stress tolerance toSaccharomyces cerevisiaebased on DNA microarray data analysis. J Biotechnol,2007, 131(1): 34−44.

[9]Dinh TN, Nagahisa K, Yoshikawa K, et al.Analysis of adaptation to high ethanol concentration inSaccharomyces cerevisiaeusing DNA microarray. Bioprocess Biosyst Eng, 2009,32(5): 681−688.

[10]Zhang XY, Du FG, Chi XQ, et al. Construction ofSaccharomyces cerevisiaestrains improved stress tolerance and ethanol fermentation performance through metabolic engineering and genome recombination. China Biotechnol, 2011, 31(7):91−97 (in Chinese).

张晓阳, 杜风光, 池小琴, 等. 代谢工程与全基因组重组构建酿酒酵母抗逆高产乙醇菌株. 中国生物工程杂志, 2011, 31(7): 91−97.

[11]Hasunuma T, Sanda T, Yamada R, et al. Metabolic pathway engineering based on metabolomics confers acetic and formic acid tolerance to a recombinant xylose-fermenting strain ofSaccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact, 2011,10(2):1−13.

[12]Pinel D, D'Aoust F, Cardayre SB, et al.Saccharomyces cerevisiaegenome shuffling through recursive population mating leads to improved tolerance to spent sulfite liquor. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(14): 4736−4743.

[13]Alper H, Moxley J, Nevoigt E, et al. Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science, 2006,314(5805): 1565−1568.

[14]Liu HM, Yan M, Lai CG, et al. gTME for improved xylose fermentation ofSaccharomyces cerevisiae.Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(2): 574−582.

[15]Zhao XQ, Bai FW. Zinc and yeast stress tolerance:Micronutrient plays a big role. J Biotechnol, 2012,15(84): 176−183.

[16]Lewis JA, Elkon IM, McGee MA, et al. Exploiting natural variation inSaccharomyces cerevisiaeto identify genes for increased ethanol resistance.Genetics, 2010, 186(4): 1197−1205.

[17]Araki Y, Wu H, Kitagaki H, et al. Ethanol stress stimulates the Ca2+-mediated calcineurin/Crz1 pathway inSaccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng, 2009, 107(1): 1−6.

[18]Sera T. Zinc-finger-based artificial transcription factors and their applications. Adv Drug Delivery Rev, 2009, 61(7): 513−526.

[19]Park KS, Lee DK, Lee H, et al. Phenotypic alteration of eukaryotic cells using randomized libraries of artificial transcription factors. Nat Biotechnol, 2003, 21(10): 1208−1214.

[20]Lee JY, Sung BH. Phenotypic engineering by reprogramming gene transcription using novel artificial transcription factors inEscherichia coli.Nucleic Acids Res, 2008, 36(16): 1−10.

[21]Amberg DC, Huo KK. Methods in Yeast Genetics.Beijing: Science Press, 2009: 87−88 (in Chinese).

安伯格, 霍克克. 酵母遗传学方法试验指南. 北京: 科学出版社, 2009: 87−88.

[22]Zhao XQ, Xue C, Ge XM, et al. Impact of zinc supplementation on the improvement of ethanol tolerance and ethanol yield of self-flocculating yeast in continuous ethanol fermentation. J Biotechnol, 2009, 139(1): 55−60.

[23]Bae KH, Kwon YD, Shin HC, et al. Human zinc fingers as building blocks in the construction of artificial transcription factors. Nat Biotechnol,2003, 21(3): 275−280.

[24]Lee DK, Park JW, Kim YJ, et al. Toward a functional annotation of the human genome using artificial transcription factors. Genome Res, 2003,13(12): 2708−2716.

[25]Xu GH, Zhao XQ, Bai FW, et al. Improvement of acetic acid tolerance of self-flocculating yeast by zinc supplementation. CIESC J, 2012, 63(6):1823−1829 (in Chinese).

徐桂红, 赵心清, 白凤武, 等. 锌离子提高絮凝酵母高浓度乙酸胁迫耐受性的研究. 化工学报,2012, 63(6): 1823−1829.

November 11, 2012; Accepted: January 4, 2013

Xinqing Zhao. Tel: +86-411-84706319; Fax: +86-411-84706329; E-mail: xqzhao@dlut.edu.cn

国家自然科学基金 (No. 21076040)，国家高技术研究发展计划 (863计划) (Nos. 2012AA101805，2012AA021205) 资助。

Breeding of robust industrial ethanol-tolerantSaccharomyces cerevisiaestrain by artificial zinc finger protein library

Cui Ma1, Xinqing Zhao1, Qian Li1, Mingming Zhang1, Jin Soo Kim2, and Fengwu Bai1

1School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian116024,Liaoning,China
2ToolGen,Inc.,Seoul, 153-023,South Korea

Breeding of robust industrialSaccharomyces cerevisiaestrains with high ethanol tolerance is of great significance for efficient fuel ethanol production. Zinc finger proteins play important roles in gene transcription and translation, and exerting control on the regulation of multiple genes. The sequence and localization of the zinc finger motif can be designed and engineered, and the artificial zinc finger protein can be used to regulate celluar metabolism. Stress tolerance of microbial strains is related to multiple genes. Therefore, it is possible to use artificially-designed zinc finger proteins to breed stress tolerant strains. In this study, a library containing artificial zinc finger protein encoding genes was transformed into the model yeast strain S288c. A recombinant strain named M01 with improved ethanol tolerance was obtained. The plasmid in M01 was isolated, and then transformed into the industrial yeast strain Sc4126. Ethanol tolerance of the recombinant strain of Sc4126 were significantly improved. When high gravity ethanol fermentation using 250 g/L glucose was performed, comparing with the wild-type strain, fermentation time of the recombinant strain was decreased by 24 h and the final ethanol concentration was enhanced by 6.3%. The results of this study demonstrate that artificial zinc finger proteins are able to exert control on stress tolerance of yeast strains, and these results provide basis to construct robust industrial yeast strains for efficient ethanol fermentation.

Saccharomyces cerevisiae, artificial zinc finger protein, ethanol tolerance, ethanol fermentation

Supported by: National Science Foundation of China (No. 21076040), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program) (Nos. 2012AA101805, 2012AA021205).

(本文责编 陈宏宇)