HPLC 法同时测定忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸含量

时新刚 ，舒希凯，2 ，刘伟 ，刘峰 ，李圣波 ，王晓，王岱杰*

(1.山东省分析测试中心，山东 济南 250014;2.山东师范大学生命科学学院，山东 济南250014;3.山东亚特生态技术有限公司，山东 临沂 266071)

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或待初开的花，是我国传统中药及保键饮品的常用大宗原料，具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆等功能［1］。现代药理研究表明，金银花中主要成分为绿原酸、异绿原酸等酚酸类物质以及木犀草苷等黄酮类物质［2-3］，药典［1］中将木犀草苷和绿原酸作为金银花的指标成分。

长期以来忍冬花蕾和初花作为主要利用部位大量入药，并作为提取绿原酸、木犀草苷等物质的工业原料［4-6］。而忍冬叶是生产金银花的副产品，虽然产量较高，约为花的5 倍，却一直被视为非药用部位而长期未得到有效利用。有研究表明，忍冬叶中所含的药理活性物质与花相近或高于花［7］，其提取物具有较为广泛的抗微生物作用［8］，极具开发价值。本文通过测定比较3 种具有代表性的忍冬的花和叶中木犀草苷和绿原酸的含量，为忍冬叶的进一步综合利用提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1120 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);KT-300Y 超声波药品处理机;AE240 电子分析天平(Mettler 公司)。

乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，均购自山东禹王试剂公司;水为高纯水。木犀草苷和绿原酸对照品自制，纯度均大于98%;药材为亚特、意大利、九丰一号的花、叶，经山东中医药大学李佳副教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的花蕾和叶。

1.2 色谱条件方法

Shim-pack-ODS 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相A=0.2 %的甲酸水，流动相B=乙腈;检测波长350 nm;柱温25℃;进样量10 μL;梯度洗脱:0～15 min(10 %～20 %B)，15～30 min(20 % B)。

1.3 标样和样品溶液的制备

标样溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量，配制成浓度分别为0.005、0.01、0.05、0.1、0.3 mg·mL-1的对照品溶液;精密称取绿原酸对照品适量，配制成浓度分别为0.1，0.25，0.5，1.25，2.5 mg·mL-1的对照品溶液。

样品溶液的制备:精密称取过4 号筛金银花药材粉末0.3 g，置锥形瓶中，加入70 %甲醇100 mL，称定;超声提取20 min，称重;分别用70%甲醇补足重量，摇匀，过滤，浓缩并定容至25 mL 作为样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 线性关系

分别吸取木犀草苷和绿原酸对照品溶液10 μL 进样。以对照品标准溶液浓度为横坐标(X)，其峰面积为纵坐标(Y)线性回归，木犀草苷的回归方程为Y=6 ×108X +461735，R=0.9998，绿原酸的回归方程为Y=6 ×108X+ 4 × 106，R=0.9997。结 果 表 明，木 犀 草 苷 在0.005～0.3 mg · mL-1，绿 原 酸 在0.1～2.5 mg·mL-1呈良好的线性关系。

2.2 精密度实验

取同一批次亚特忍冬花样品溶液，连续进样6 次，木犀草苷和绿原酸的RSD 分别为0.35 %、0.27 %，精密度良好。

2.3 稳定性实验

取同一批次亚特忍冬花样品溶液，分别于0、3、6、9、12、18、24 h 进行测定，结果木犀草苷和绿原酸的RSD 分别为0.52 %、0.41 %，结果表明，样品溶液在24 h 内稳定。

2.4 重复性实验

取同一批次亚特忍冬花样品6 份，每份0.1 g，精密称定，按1.3 样品溶液的制备方法制备。木犀草苷和绿原酸的RSD 分别为0.84 %、0.65 %，表明该方法重复性良好。

2.5 加样回收率实验

取同一批次亚特忍冬叶样品6 份，每份0.15 g，精密称定，分别加入与样品相当量的绿原酸对照品溶液(2.5 mg·mL-1)2.0 mL 和木犀草苷对照品溶液(0.3 mg·mL-1)3.0 mL，按1.3 样品溶液制备方法制备，并按1.2 色谱条件进行测定，分别计算木犀草苷和绿原酸的加样回收率，结果见表1，2。

表1 木犀草苷的加样回收率实验结果(n=6)Table 1 Recovery rate of luteoloside (n=6)

表2 绿原酸的加样回收率实验结果(n=6)Table 2 Recovery rate of chlorogenic acid (n=6)

2.6 样品含量的测定

对照品及样品HPLC 色谱图见图1。由图可见，在该分析条件下，木犀草苷、绿原酸色谱峰与其它组分分离效果良好。取不同品种的忍冬花和叶的干燥粉末约0.3 g，精密称定，按1.3 样品制备方法制备，按1.2 色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积，计算木犀草苷和绿原酸的含量，见表3。

表3 样品测定结果Table 3 Determination results of three kinds of Lonicera japonica Thunb.

图1 混合对照品及样品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and samples

3 结论

本文通过比较3 种具有代表性的忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸的含量，发现叶中木犀草苷含量远远高于花，尤其在亚特品种中差别达12.7 倍。绿原酸是金银花中的主要活性成分之一，具有消炎、抗菌等作用［9］。木犀草苷具有多种生理活性，对缺血缺氧培养的乳鼠的心肌细胞有保护作用［10］，对K562 细胞增殖也具有抑制作用［11］，是一种潜在的抗癌药物。因此，忍冬叶是一种开发木犀草苷等黄酮类化合物的优质原料。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:化学工业出版社，2010:205 -206.

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［3］朱丹，袁芳，孟坤，等.黄酮类化合物的研究进展［J］.中华中医药志，2007，22(6):387 -389.

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［10］周玲，解砚英，李杰，等.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对缺血缺氧培养的乳鼠的心肌细胞有保护作用［J］.中药新药与临床药理，2008(4):259 -261.

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