他莫昔芬对肝癌HepG2细胞脂质代谢的影响

李 霞，周望溪，席美凤（湖南永州市中心医院北院药剂科，湖南永州 425000）

他莫昔芬（Tamoxifen）是一种选择性雌激素受体调节剂，被广泛应用于治疗乳腺癌和妇科恶性肿瘤[1-3]。根据国内外研究[4-5]表明，43%的患者在使用他莫昔芬后两年内都会产生非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），导致肝脏脂质沉积，并可能进一步发展为脂肪型肝炎和肝硬化。近年来关于他莫昔芬导致脂肪肝的体外分子机制研究报道较少。本研究拟通过建立他莫昔芬诱导肝细胞产生脂质沉积模型，探讨他莫昔芬对肝细胞脂质合成与代谢途径的影响，并进一步明确其导致肝细胞脂质沉积可能的分子机制，为选择和开发治疗乳腺癌和妇科肿瘤更加安全和有效的药物提供理论基础。

1 材料

CFX96TM聚合酶链式反应（PCR）仪、凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；BX51显微镜（日本Olympus公司）。

他莫昔芬原料药（批号：T5648，纯度：≥99%）和棕榈酸原料药（批号：57-10-3，纯度：≥99%）均购自美国Sigma-Aldrich公司；Trizol试剂（美国Invitrogen生命技术公司，批号：15596026）；乙酰辅酶A羧化酶（ACC）一抗及其磷酸化（PACC）一抗（美国Abcam公司，批号：ab63531、ab31931）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗、MTT试剂（中国碧云天生物技术研究所，批号：A0208、ST316）；1640培养基和胎牛血清（美国Hyclone公司，批号：SH30809.01B、SV300087.02）。

人肝癌HepG2细胞，由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。

2 方法

2.1 细胞培养

将HepG2细胞复苏后接种于50ml细胞培养瓶，用含10%胎牛血清的1640培养基培养，置于37℃、CO2孵育箱中，2d换液1次，传代至第3代时进行试验。

2.2 HepG2细胞增殖检测

将HepG2细胞接种于96孔板，接种密度为每孔6000个，分为6组，每组设3个复孔。空白对照组为不作处理的细胞，另外5组分别为用0.5、1、5、15、30μmol/L他莫昔芬处理后的细胞。培养48h后每孔加入20µl的MTT试剂（5mg/ml），继续培养4h后吸弃培养基，每孔加入150µl的二甲基亚砜，充分混匀后用酶标仪于490nm波长处测定各孔的光密度（OD）值。OD值越大，则表明细胞增殖越明显。

2.3 HepG2细胞脂质沉积检测

将HepG2细胞接种于爬片，分为空白对照组、阳性对照组（200μmol/L棕榈酸溶液[6]）和0.5、1、5μmol/L他莫昔芬组，每组设3个复孔，分别加入相应药物处理细胞诱导脂质沉积。各组细胞培养48h后吸弃培养基，4%多聚甲醛固定10min，油红O染色20min，以质量比为60%的异丙醇分化，苏木素复染胞核。400倍显微镜下观察各组细胞脂质沉积情况，以细胞内红色脂滴明显增多表示脂质沉积明显。

2.4 HepG2细胞内脂肪酸（FA）合成、氧化相关基因的表达检测

将HepG2细胞接种于6孔板，分为空白对照组和他莫昔芬（5μmol/L）组，每组设3个复孔，加入相应药物处理细胞，培养12h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录成cDNA。荧光定量PCR法检测细胞内FA合成酶（FAS）、固醇调节元件结合蛋白1c（Srebp-1c）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的表达和FA氧化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）和解偶联蛋白2（UCP-2）的表达。引物采用Primer 5软件设计，FAS上 游 序 列 ：5′-CGCTCGGCATGGCTATCT-3′，下 游 序 列 ：5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′；ACC 上游序列：5′-ATCCGCGGCTATATGAAAACA-3′，下游序列：5′-TCGTAGTGGGCTTGCTGAAA-3′；Srebp-1c上游序列：5′-CGGAACCATCTTGGCAACA-3′，下 游 序 列 ：5′-GCCGGTTGATAGGCAGCTT-3′；PPAR-α上游序列：5′-GGGCACCTGGAGGTATCGT-3′，下 游 序 列 5′-GGGACCCTTATCAATCCTAATCATT-3′；UCP-2上游序列：5′-CCATCTCCTGGGACGTAGCA-3′，下游序列：5′-GGCACATCTGTGGCCTTGA-3′。以他莫昔芬组各基因表达与空白对照组各基因表达的比值为指标。

2.5 HepG2细胞内ACC和P-ACC蛋白表达检测

将HepG2细胞接种于6孔板，分为空白对照组和他莫昔芬（5μmol/L）组，每组设3个复孔，加入相应药物处理细胞，培养12h后，分别加入适量的蛋白裂解液于冰上裂解细胞提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。依次进行聚丙烯酰氨凝胶电泳、转膜、封闭，加入ACC和P-ACC一抗4℃孵育过夜，加入HRP标记山羊抗兔二抗孵育1h，化学发光、显影、定影，凝胶成像仪采集图像，结果采用Quantity One软件进行条带灰度值分析。

2.6 统计学分析

各组数据采用GraphPad Prism 5软件分析。各组数据用±s表示，结果采用方差分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

3 结果

3.1 HepG2细胞增殖情况

与空白对照组比较，0.5、1、5μmol/L他莫昔芬对HepG2细胞增殖无明显影响（P＞0.05），15、30μmol/L他莫昔芬能明显抑制HepG2细胞的增殖（P＜0.05）。各组HepG2细胞增殖情况比较见表1。

表1 各组HepG2细胞增殖情况比较（±s，n＝3）Tab 1 Comparison of the proliferation of HepG2cells of each group（±s，n＝3）

表1 各组HepG2细胞增殖情况比较（±s，n＝3）Tab 1 Comparison of the proliferation of HepG2cells of each group（±s，n＝3）

与空白对照组比较：＊P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05

OD值1.03±0.041.01±0.050.99±0.080.96±0.090.81±0.02＊0.67±0.05＊组别空白对照组0.5μmol/L他莫昔芬组1μmol/L他莫昔芬组5μmol/L他莫昔芬组15μmol/L他莫昔芬组30μmol/L他莫昔芬组

3.2 HepG2细胞脂质沉积情况

空白对照组HepG2细胞未作任何处理，故细胞内无明显脂质沉积。与空白对照组比较，5μmol/L他莫昔芬组细胞内红色脂滴明显增多，表明出现脂质沉积，且与阳性对照组相似；而0.5、1μmol/L他莫昔芬组细胞内脂质沉积不明显。各组HepG2细胞内脂质沉积显微镜图见图1。

3.3 HepG2细胞内FA合成、氧化相关基因的表达情况

图1 各组HepG2细胞内脂质沉积显微镜图（×400）A.空白对照组；B.0.5μmol/L他莫昔芬组；C.1μmol/L他莫昔芬组；D.5μmol/L他莫昔芬组；E.阳性对照组Fig 1 Microscopic images of lipid accumulation of HepG2cells of each grou（p×400）A.blank control group；B.0.5μmol/L tamoxifen group；C.1μmol/L tamoxifen group；D.5μmol/L tamoxifen group；E.positive control group

与空白对照组（1.00±0）比较，他莫昔芬组细胞内FAS（1.37±0.08）mRNA表达明显增强（P＜0.05），ACC（1.02±0.18）、Srebp-1c（0.94±0.07）、PPAR-α（0.93±0.06）和 UCP-2（0.93±0.06）mRNA表达无明显变化。提示他莫昔芬可通过通过增加FA的合成来增加HepG2细胞内的脂质沉积，FA的氧化对减少HepG2细胞内的脂质沉积起着重要作用。

3.4 HepG2细胞内ACC和P-ACC蛋白表达情况

与空白对照组比较，他莫昔芬组细胞内ACC蛋白表达无明显变化（P＞0.05），P-ACC蛋白表达明显降低（P＜0.05）。两组HepG2细胞内ACC、P-ACC蛋白表达电泳图见图2，表达量比值比较见图3。

图3 两组HepG2细胞内ACC/P-ACC蛋白表达量比值比较与空白对照组比较：＊P＜0.05Fig 3 Comparison of protein expression ratio of ACC to PACC in HepG2cells of 2groupsvs.blank control group：＊P＜0.05

图2 两组HepG2细胞内ACC、P-ACC蛋白表达电泳图Fig 2 Electrophoretogram of protein expression of ACC and P-ACC in HepG2cells of 2groups

4 讨论

在NAFLD病理过程中，一般伴有肝细胞脂质代谢紊乱，富余脂质尤其是甘油三酯（TG）的沉积是NAFLD形成发展的先决条件[7]。在本试验中，空白对照组与他莫昔芬组均未给予外部FA刺激，5μmol/L他莫昔芬组HepG2细胞内出现明显的脂质沉积，提示给予他莫昔芬刺激HepG2细胞后，细胞自身合成FA可能是增加的。因此本研究检测了ACC、FAS、Srebp-1c mRNA的表达水平，结果5μmol/L他莫昔芬组细胞内FAS mRNA表达明显增强。FAS是合成FA的关键酶，位于细胞浆内，普遍表达于肝、肾、脑、肺等组织中，特别是肝脏组织[8]。FAS在催化内源性长链FA合成过程中起着重要作用。ACC是FA重头合成的限速酶，其79位的丝氨酸去磷酸化能使ACC激活，导致FA合成增加[9-10]。因此本研究检测了ACC及P-ACC蛋白表达，根据结果表明5μmol/L他莫昔芬组细胞内P-ACC蛋白表达明显降低。由此导致的肝脏自身合成FA增加可能是FA蓄积的原因之一。

此外，正常有效的FA氧化对减少HepG2细胞中的脂质沉积是必要的。FA代谢关键调控因子及其控制的关键酶，在FA氧化中都起重要作用，其表达和功能发生异常，也是造成FA代谢紊乱主要原因之一[11]。因此本研究检测了FA氧化相关基因PPAR-α、UCP-2，结果空白对照组与5μmol/L他莫昔芬组无统计学差异。

综上所述，本次研究首次通过体外细胞模型观察到他莫昔芬能够通过增加FA合成来导致HepG2细胞脂质沉积，抑制P-ACC水平是其可能的作用机制之一，为进一步明确其副作用机制和开发新药提供了理论基础。

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