硒化壳聚糖抑制耐多柔比星K562细胞增殖及对PI-3K/Akt信号通路的影响Δ

邓守恒，王贤和，袁选举，李 芳，李林均，陈 萍（湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心，湖北十堰442000）

肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药是导致化疗失败的主要原因。近年来，人们围绕这一难题进行了大量的研究，主要采用的方法有化学药物干预和基因治疗等。维拉帕米和环孢霉素A是被研究最多的化学药物，但由于其毒副作用大、特异性差，实际应用中效果并不理想。而基因治疗也存在着易被DNA酶降解、治疗效果不能持久等问题，从而使其临床应用受限。硒化壳聚糖是将壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下，以混合金属离子为催化剂，通过拼合原理制备成的有机硒，具有高效低毒的特性[1]。硒和砷在化学周期表中属同族，研究[2-3]证实砷剂能恢复部分耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，推测硒剂也应具有相似的作用，本文对此进行了研究。

1 材料

1.1 仪器

BMP型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Mod 550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药品与试剂

硒化壳聚糖（本院化学系合成，批号：100601-201016，硒含量：0.8%）；多柔比星（Doxorubicin，DOX）注射用粉末（浙江海正药业股份有限公司，批号：090606，规格：每支10mg）；MTT、甲基纤维素（美国Sigma公司）；磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（p-Akt）多克隆抗体及二抗（美国Santa Cruz公司）。

1.3 细胞

人慢性粒细胞白血病（CML）耐DOX细胞株（K562/DOX）购自中国医学科学院天津血液病研究所。

2 方法

2.1 细胞培养

K562/DOX细胞培养于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和2u/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培养基内，在培养体系中加入终质量浓度为0.6μg/ml的DOX以维持其耐药性，于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养，每隔3～4d传代1次。

2.2 MTT法检测细胞抑制率

收集指数生长期的K562/DOX细胞以全培养液稀释成5×104ml－1的单细胞悬液，接种于96孔板，于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养12h，将细胞分为阴性对照组（RPMI 1640培养基）、DOX组（50μg/ml DOX）和25、50、100、200、400μg/ml硒化壳聚糖组（50μg/ml DOX+相应浓度的硒化壳聚糖），每组4个复孔。各组加样后继续培养12、24、36h，每孔加入MTT 10µl，继续培养 4h，弃上清，加入200µl二甲基亚砜（DMSO），酶标仪检测570nm波长处光密度（OD）值并计算细胞抑制率。试验重复3次，比较各组细胞抑制率的差异并计算逆转倍数。细胞抑制率（%）＝（1－硒化壳聚糖组OD值/阴性对照组OD值）×100%；逆转倍数＝硒化壳聚糖组半数抑制率/DOX组半数抑制率。

2.3 克隆形成法检测细胞存活率

参照文献[4]配制半固体培养基，收集“2.2”项下各组作用12h的细胞，弃去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗去药物，1000r/min离心3min，用含20%胎牛血清的培养液稀释成7.0×103ml－1单细胞悬液，于预先每孔加入1.2%甲基纤维素培养基1.0ml的24孔板中，加入单细胞悬液50µl，每个浓度设4个复孔。混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育12～14d，于倒置相差显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率（DOX组或硒化壳聚糖组平均克隆数/阴性对照组平均克隆数×100%）。试验重复3次，比较各组细胞存活率的差异。

2.4 免疫印迹法测定p-Akt蛋白的表达

细胞分组方法同“2.2”项，即分为DOX组（50μg/ml DOX）和100、200μg/ml硒化壳聚糖组（50μg/ml DOX+相应浓度的硒化壳聚糖），作用24h后收集各组细胞，PBS洗2次，裂解，离心，收集上清，即为细胞总蛋白。进行蛋白定量，调节每份样品蛋白浓度，加等量蛋白于上样缓冲液中，煮沸，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后转膜。依次加入p-Akt多克隆抗体及二抗，显色，拍照，Quanti Scan软件进行密度扫描分析。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，比较各组细胞p-Akt蛋白条带灰度值与β-actin灰度值比值的差异。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 细胞抑制率和存活率检测结果

MTT法检测结果显示，DOX组对K562/DOX细胞的抑制作用有限，作用12、24、36h的抑制率分别为28.17%、36.72%、40.14%，说明细胞对DOX确实存在耐药。25～400μg/ml硒化壳聚糖组对K562/DOX细胞的抑制作用明显高于DOX组，且与浓度、时间呈正相关。25、50、100、200、400μg/ml硒化壳聚糖组作用12h，对K562/DOX细胞的逆转倍数分别是1.11、1.57、1.68、2.09、2.51，说明硒化壳聚糖能逆转K562/DOX细胞对DOX的耐药，对细胞增殖产生了明显的抑制作用。克隆形成法检测结果也显示，DOX与硒化壳聚糖联用，对细胞克隆形成有明显的抑制作用，细胞存活率与DOX组比较明显降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈一定的量效关系。各组作用不同时间后细胞的抑制率见图1；各组作用12h后细胞的抑制率、逆转倍数、存活率比较见表1。

图1 各组作用不同时间后K562/DOX细胞的抑制率与DOX组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 1 Proliferative inhibitory rate of K562/DOX cells effected for different time in each groupvs.DOX group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表1 各组作用12h后K562/DOX细胞的抑制率、逆转倍数、存活率比较（±s，n＝4）Tab 1 Proliferative inhibitory rate，reversal multiple，survival rate of K562/DOX cells effected for 12h in each group（±s，n＝4）

表1 各组作用12h后K562/DOX细胞的抑制率、逆转倍数、存活率比较（±s，n＝4）Tab 1 Proliferative inhibitory rate，reversal multiple，survival rate of K562/DOX cells effected for 12h in each group（±s，n＝4）

与DOX组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.DOX group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

存活率，%73.21±3.1260.16±4.14＊49.23±3.37＊＊38.49±4.35＊＊25.62±3.29＊＊12.84±1.83＊＊逆转倍数组别DOX组25μg/ml硒化壳聚糖组50μg/ml硒化壳聚糖组100μg/ml硒化壳聚糖组200μg/ml硒化壳聚糖组400μg/ml硒化壳聚糖组抑制率，%28.17±3.1431.14±2.8744.25±4.18＊47.52±4.69＊＊59.16±5.43＊＊70.97±9.58＊＊1.111.571.682.092.51

3.2 细胞内p-Akt蛋白表达情况

结果显示，DOX组细胞内p-Akt蛋白呈高表达（灰度比值为0.9917±0.29），细胞经100、200μg/ml硒化壳聚糖作用24h后，细胞内p-Akt蛋白表达的灰度比值分别为（0.4982±0.24）、（0.3714±0.33）。与DOX组比较，100、200μg/ml硒化壳聚糖组细胞内p-Akt蛋白表达明显降低（P＜0.01），即下调（42.76±2.21）%、（62.17±3.44）%。3组细胞内p-Akt蛋白表达的电泳图见图2。

4 讨论

图2 3组K562/DOX细胞内p-Akt蛋白表达的电泳图Fig 2 Electrophoretogram of the protein expression of p-Akt in K562/DOX cells in 3groups

CML是以费城（Ph）染色体为特征的多潜能干细胞异常的血液系统恶性肿瘤。Ph染色体是由位于9号染色体上的c-abl基因与位于22号染色体上的bcr基因相互异位，产生bcr-abl融合基因，该基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，可使融合蛋白自身及细胞内多种底物分子磷酸化，从而激活包括Ras/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在内的多条细胞信号传导通路，调控细胞的分裂与增殖，与CML的发病及耐药密切相关[5]。故而降低CML细胞内融合蛋白含量、抑制其酪氨酸激酶活性、阻断其可能的细胞信号传导途径，已成为当前针对分子靶点进行治疗的策略之一。

笔者前期研究结果显示，硒化壳聚糖可通过下调NF-κB通路对体外培养的CML细胞株K562增殖产生抑制[6]，且可对细胞特征性的P210融合蛋白产生明显的下调作用[7]，提示硒化壳聚糖可能会对K562耐药细胞产生逆转作用。本文中，笔者以DOX诱导建立的K562/DOX为研究对象，采用经典的MTT法和克隆形成法检测了硒化壳聚糖对K562/DOX细胞体外增殖和存活的影响。结果显示，单纯DOX对细胞的抑制效果有限，而与不同浓度硒化壳聚糖联用后，DOX对细胞的抑制率明显高于DOX组，且呈现出一定的量效和时效关系，说明硒化壳聚糖具有逆转K562/DOX细胞耐DOX的作用。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）是磷脂酰肌醇依赖激酶家族成员，参与细胞增殖、分化和细胞骨架构筑等的调控[8]；Akt是PI-3K最主要的靶酶，与多种细胞活动、物质代谢调节有关，尤其与抑制细胞凋亡、促进细胞生存有密切关系[9]。已有研究[10]表明，部分肿瘤细胞可以通过对负责细胞生长和凋亡的细胞信息传导通路（如Akt和NF-κB通路）进行调控，从而获得对化疗药物的耐药性。本文研究结果则进一步证实了在耐药的K562/DOX细胞内存在着PI-3K/Akt信号通路的异常激活，而硒化壳聚糖则能通过下调p-Akt水平对PI-3K/Akt信号通路产生抑制进而逆转K562/DOX细胞对DOX的耐药。

[1] 孙兰萍，张胜义，许晖.硒化壳聚糖的制备及理化性质的研究[J].食品工业科技，2006，27（2）：145.

[2] 杨东光，张日，朱子玲.三氧化二砷逆转甲磺酸伊马替尼对K562/MDR1耐药的实验研究[J].苏州大学学报：医学版，2007，27（2）：178.

[3] 吴广洲，沈振亚，刘国锋，等.三氧化二砷对人肺腺癌细胞A549/DDP裸鼠体内的多药耐药逆转作用[J].苏州大学学报：医学版，2011，31（1）：79.

[4] 韩锐.抗癌药物研究与实验技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996：284.

[5] Tanaka MF，Kantarjian H，Cortes J，et al.Treatment options for chronic myeloid leukemia[J].Expert Opin Pharmacother，2012，13（6）：815.

[6] 邓守恒，孙各琴，朱名安，等.硒化壳聚糖对K562细胞的作用及其与NF-κB信号分子的关系[J].陕西医学杂志，2005，34（12）：1472.

[7] 邓守恒，李芳，李林均，等.硒化壳聚糖对慢性粒细胞白血病K562细胞bcr/abl融合基因表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：106.

[8] Kim D，Cheng GZ，Lindsley CW，et al.Targeting the phosphatidylinositol-3kinase/Akt pathway for the treatment of cancer[J].Curr Opin Investig Drugs，2005，6（12）：1250.

[9] Kim D，Dan HC，Park S，et al.AKT/PKB signaling mechanisms in cancer and chemoresistance[J].Froni Biosci，2005（10）：975.

[10] Poh TW，Pervaiz S.LY294002and LY303511sensitize tumor cells to drug-induced apoptosis via intracellular hydrogen peroxide production independent of the phoshpoinositide-3kinase-Akt pathway[J].Camcer Res，2005，65（14）：6264.