CD13+CD133+和CD13－CD133－肝癌细胞的生物学差异及临床意义

金世龙，黄中荣，陈华，余天雾，曹洪，龙运全，周健，李鹤，苟毅，李远，廖娟

在肿瘤组织中，极少量致瘤性细胞亚群具有无限增殖的潜能，对化疗药物存在抗药性，它们在肿瘤组织中充当着干细胞的角色，并在启动肿瘤形成和维持生长中起决定性作用。研究显示，肿瘤复发和转移的根源可能与肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)有关，且越来越多的研究注意到了CSCs的重要性，并在分选基础上进行CSCs自我更新﹑分化，形成肿瘤球和移植成瘤能力等的分析[1-2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)为第五大常见癌症，病死率位居第三，治疗效果差且易复发和转移[3-5]。本研究采用CD13﹑CD133双抗体分选人肝癌HuH7细胞系，研究CD13+CD133+HCC和CD13－CD133－HCC细胞的生物学特征，为临床肝癌治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 人肝癌HuH7细胞系由第三军医大学西南医院病理研究所提供。CD13荧光抗体(PE)购自BD公司；CD133荧光抗体(APC)购自美天尼公司；DMEM/F12(1:1)﹑DMEM培养基﹑胎牛血清(FBS)为Hyclone产品；RPMI 1640培养基为IVD产品。流式细胞仪BD FACS Aria Ⅱ和BD FACSCalibur，全波长酶标仪Thermo Multiskan Spectrum。

1.2 HuH7细胞培养 HuH7细胞在含10% FBS的DMEM培养液中于37℃﹑5%CO2﹑饱和湿度的培养箱中孵育，待细胞融合度达到70%～80%时以0.25%胰酶消化细胞。

1.3 CD13+CD133+HCC细胞的分选 常规消化HuH7细胞，制成单细胞悬液并计数，PBS洗1次，置于1.5ml EP管中，设置空白对照组和CD13/CD133双抗体组。每管中加入5μl抗体，4℃避光孵育30min，700r/min离心5min，弃上清，PBS洗3次，300μl PBS重悬细胞，流式细胞仪分选细胞。

1.4 CD13+CD133+﹑CD13－CD133－HCC细胞增殖情况 将分选后的HuH7细胞分别接种于96孔板，每孔加1×103个细胞，加入200μl含10%FBS的DMEM培养基，2～3d换液，每组设5个复孔及空白对照孔。培养24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，孵育4h，吸出培养基，加入150μl DMSO，室温下振摇10min，在酶标仪上测定490nm处的吸光度(A)值，绘制细胞生长曲线。

1.5 CD13+CD133+﹑CD13－CD133－HCC对5-FU和吡柔比星的敏感性分析 细胞贴壁后分别加入不同浓度5-FU(5﹑10﹑20μg/ml)和吡柔比星(1﹑10﹑20μg/ml)，每种浓度设5个复孔，设调零孔(不加细胞)和对照孔(不加药物)，在37℃﹑5%CO2﹑饱和湿度的培养箱中分别孵育24﹑48﹑72h，弃培养液，每孔分别加入180μl DMEM培养基和20μl MTT溶液，继续培养4h；吸出培养液，分别加入150μl DMSO，室温下振摇10min，在酶标仪上测定490nm处的A值，计算细胞存活率，确定细胞对抗癌药物的敏感性。

1.6 裸鼠体内成瘤情况分析 将新分选的CD13+CD133+HCC细胞按1.0×103﹑5.0×103﹑1.0×104﹑5.0×104个细胞分为4组，采用PBS配成100μl细胞悬液，注射到裸鼠(清洁级)腹部皮下，每组5只。CD13－CD133－HCC细胞设1.0×104﹑1.0×105个细胞组做对照。每周观察成瘤情况。

1.7 HuH7细胞系两亚群的细胞周期测定 取HuH7细胞系两亚群各1×106个分选细胞制成悬液；加入－20℃乙醇500μl固定，PBS洗涤，重悬；加入5μl RNase(50μg/ml)室温放置20min，800r/min离心5min，细胞悬于95μl PBS；加入5μl PI溶液(5μg/ml)，冰上放置30min，流式细胞仪检测DNA含量。

1.8 流式细胞术检测HuH7细胞系两亚群的分化情况 常规消化HuH7细胞，制成单细胞悬液并计数，PBS洗1次，置于1.5ml EP管中，设置空白对照管﹑CD13﹑CD133﹑CD13-CD133双抗体4组。每管中加入5μl抗体，4℃避光孵育30min，700r/min离心5min，弃上清，PBS洗3遍，300μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测CD13﹑CD133标志表达情况。

2 结 果

2.1 CD13+CD133+和CD13－CD133－HCC细胞生长曲线 CD13+CD133+HCC细胞增殖较快，最初2d为平台期，至第3天增殖明显；而CD13－CD133－HCC增殖较慢，到第7天增殖加快，但只有CD13+CD133+HCC的1/2(图1)。

图1 HuH7细胞亚群生长曲线比较Fig.1 The growth curves of subgroup of HuH7 cells

2.2 HuH7两种细胞亚群对5-FU和吡柔比星的敏感性分析 30μg/ml 5-FU持续作用48h后，CD13+CD133+HCC细胞存活率为70%，对5-FU抵抗；而CD13－CD133－HCC细胞较易被杀死，10μg/ml 5-FU作用48h后细胞存活率仅为40%，30μg/ml作用48h细胞存活率为10%(图2A)，两亚群对5-FU的反应存在较大差异。不同浓度吡柔比星作用48h仍有10%～40%CD13+CD133+HCC细胞存活，耐受性强于CD13－CD133－HCC(图2B)，提示CD13+CD133+HCC细胞具有抗化疗特征。

2.3 CD13+CD133+HCC细胞在裸鼠体内的成瘤情况 1×103个CD13+CD133+HCC细胞在裸鼠体内即可成瘤(1/5)，1×104个CD13+CD133+HCC细胞可使4只裸鼠成瘤(4/5)；而1×104个CD13－CD133－HCC不能成瘤(0/5)，1×105个CD13－CD133－HCC细胞才能成瘤(2/5)。提示CD13+CD133+HCC细胞具有分化成癌细胞以及自我更新的能力，具备CSCs的特征。

图2 5-FU(A)及吡柔比星(B)处理48h后CD13+CD133+和CD13－CD133－HCC细胞存活率比较Fig.2 Comparison of survival rate between CD13+CD133+and CD13－CD133－HCC cells treated by 5-FU (A) or pirarubicin (B) for 48h

2.4 流式细胞仪检测HuH7细胞系两亚群的细胞周期差异 细胞周期检测结果显示，78.45%的CD13+CD133+HCC细胞处于G0/G1期(图3A)，2.19%处于G2/M，19.36%处于S期，G2/G1为2.0。62.18%的CD13－CD133－HCC细胞处于G0/G1期(图3B)，11.88%处于G2/M期，25.94%处于S期。

2.5 流式细胞仪检测HuH7细胞系两亚群的分化情况 HuH7细胞系按CD13﹑CD133表达情况分为4个亚群，即CD13+CD133+﹑CD13+CD133－﹑CD13－CD133+和CD13－CD133－HCC细胞，其中以CD13+CD133+HCC亚群居多(图4A)。培养10d后，CD13+CD133+HCC亚群细胞的CD13﹑CD133标志表达与HuH7细胞系相近(图4B)，有重建HuH7细胞的趋势；而CD13－CD133－HCC细胞亚群分化后以表达CD133标志为主(图4C)，不能完全重建HuH7细胞系的肿瘤状态。

图3 HuH7细胞系两亚群的细胞周期分布Fig.3 The cell cycle of CD13+CD133+HCC cells(A) and CD13－CD133－HCC cells (B)

图4 培养10d后CD13﹑CD133表达情况检测Fig.4 CD13 and CD133 expression 10 days after cultivation

3 讨 论

国内外研究表明，肝癌细胞系(Hep3B﹑HuH7﹑PLC/PRF/5)和肝癌组织中存在CD133+HCC细胞，这部分细胞对5-FU和阿霉素等化疗药物存在抵抗，细胞增殖较CD133－HCC细胞快，干细胞培养条件下具有形成肿瘤球的能力，裸鼠移植能够成瘤，被视为肝CSCs[6-7]。CD13是半休眠的CSCs标志物，具有减轻放化疗后DNA损伤和抗凋亡的作用，在肝癌组织和细胞中均有表达，CD13+HCC主要处于G0/G1期，可形成癌中心细胞克隆[8-9]。

本研究采用CD133﹑CD13标志，从HuH7细胞系分选出CD13+CD133+HCC细胞，占HuH7细胞总数的23.8%，且78.45%的CD13+CD133+HCC细胞处于G0/G1期，2.19%处于G2/M期，19.36%处于S期，G2/G1为2.0，具备CSCs的特征；而62.18%的CD13－CD133－HCC细胞处于G0/G1期，11.88%处于G2/M期，25.95%处于S期。两细胞亚群所处的细胞周期有明显差异。目前国内尚未见采用CD133﹑CD13标志分选肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)的研究报告。

常规培养CD13+CD133+HCC细胞，可见其增殖明显快于CD13－CD133－HCC细胞，CD13+CD133+HCC细胞多数处于G0/G1期，但增殖曲线显示快速增长，可能与新分选的CD13+CD133+HCC细胞多数处于G0/G1期，在加血清培养后部分LCSCs细胞分化成HCC细胞，部分LCSCs细胞增殖更新，而后者可以分泌HGF等因子促进HCC增殖，重建HuH7细胞系原有的细胞体系等因素有关[10-12]，而CD13－CD133－HCC细胞处于G1/G2，有追踪研究显示CD13－CD133－HCC细胞有破碎及凋亡改变[8-9]。

F A C S分选的C D 1 3+C D 1 3 3+H C C和CD 1 3－CD 1 3 3－H CC细胞经过1 0 d培养后，CD13+CD133+HCC亚群的CD13﹑CD133标志表达与HuH7细胞系相近，提示其可分化出其他3个亚群的肝癌细胞，且具有自我更新能力，有重建HuH7细胞的趋势，而CD13－CD133－HCC亚群分化后以CD133标志为主，不能维持或重建HuH7细胞系的肿瘤状态。1×103个CD13+CD133+HCC细胞在裸鼠体内即可成瘤，而CD13－CD133－HCC需要105个细胞才能成瘤，提示前者具有更强的分化成癌细胞及自我更新能力，具有CSCs的特征。CD13+CD133+HCC细胞对5-FU和吡柔比星具有抵抗特性，而CD13－CD133－HCC亚群易于杀灭，CD13+CD133+HCC细胞可减轻放化疗后的DNA损伤并具有抗凋亡作用，提示临床化疗难以彻底杀灭肝CSCs。

分析两种亚群细胞的差异性具有重要的临床意义，CD13+CD133+HCC细胞具有LCSCs的特征，可以称为CD13+CD133+LCSCs，残存CSCs可以形成转移癌灶，是肝癌治疗的靶细胞，这些LCSCs可能是肝癌复发和转移的根源，在临床治疗中应重点杀灭LCSCs，而少量CD13－CD133－HCC细胞易于被化疗药物杀灭。

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