LATS2基因在上皮性卵巢癌中的表达和临床意义

雷 静，万 霖，李惠新

(兰州大学1.第二临床医学院;2.第二医院妇科，甘肃兰州730000)

卵巢癌是临床上死亡率最高、预后最差的妇科恶性肿瘤，其发病机制与原癌基因的激活及抑癌基因的突变、缺失等密切相关。研究发现染色体13q11-q12区域的基因杂合性损伤及缺失与多种原发性肿瘤的发生密切相关［1］。LATS2基因定位于13q11-q12，编码丝/苏氨基酸蛋白激酶，定位于中心体，主要负责积累γ-微管蛋白和纺锤体的形成，通过调控细胞周期而抑制肿瘤的发生、发展［2－3］。随着对LATS2基因的广泛研究发现与人类多种恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关。目前关于LATS2基因与卵巢癌关系的研究尚未见报道。上皮性卵巢癌是最常见的类型，为此我们收集上皮性卵巢癌组织，采用SYBR Green实时定量PCR和免疫组化法检测上皮性卵巢癌组织中LATS2基因的mRNA和蛋白的表达情况，分析其与卵巢癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本及临床资料

组织标本均来自于兰州大学第二医院妇产科(浆液性囊腺癌13例，黏液性囊腺癌7例，浆液性囊腺瘤10例，正常卵巢组织10例)，并经过患者及家属的口头知情同意。石蜡切片来源于兰州大学第二医院病理科，共110例(上皮性卵巢癌58例，浆、黏液性囊腺瘤共30例，正常组织22例)，所有患者均未接受放、化疗，临床病例资料完整。

1.2 主要试剂

RNAiso Plus、cDNA和SYBR Green PCR试剂等(TaKaRa公司)，引物(大连宝生物公司)，LATS2引物序列:上游:5'-GCTTCATCCACCGAGACATCAA-3'，下 游:5'-CGACAGTTAGACACATCATCCCAGA-3'，扩增产物为198 bp;内参基因β-actin引物序列:上游:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，扩增产物为196 bp。兔抗人LATS2多克隆抗体(博奥森生物)，免疫组化所需试剂(北京中杉金桥公司)。

1.3 RT-PCR

按试剂盒说明操作，反应结束后，取5 μL RT-PCR产物于2.5%琼脂凝胶电泳，凝胶成像系统扫描。

1.4 SYBR Green实时定量PCR

按Two Step RNA PCR试剂盒说明操作，反应条件:95℃预变性30 s;95℃ 5 s及60℃ 30 s，共40个循环;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。采用 2－△△Ct法对LATS2基因进行相对定量分析。

1.5 免疫组化

按试剂盒说明书操作。LATS2蛋白阳性染色定位于胞质，DAB染色后出现棕黄色颗粒。采用双盲法随机选择10个具有代表意义的高倍视野(×200)，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，根据染色强度和阳性细胞取平均数作为本病例的最终的结果。以阳性细胞数所占比例分为:10%(－)，11% ～29%(+)，30% ～50%(++)，＞50%(+++);染色强度判定:不着色(－)，浅棕黄色(+)，棕黄色(++)，棕褐色(+++)，根据4个等级得出LATS2表达的评分。

1.6 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件，Kruskal-Wallis检验分析3组间的表达差异;两两比较采用秩和检验;LATS2与临床病理特征间的相关性采用χ2检验。

2 结果

2.1 LATS2 mRNA的表达

恶性组、良性组及正常卵巢组织中均有LATS2表达，并确定为目的条带(图1);SYBR Green实时定量PCR显示 LATS2的熔解曲线为单一峰型，LATS2扩增曲线基本平行(图2)。LATS2在卵巢癌中的表达量为正常卵巢组织中的0.084倍(P＜0.001)、良性卵巢肿瘤的 0.208倍(P＜0.01)(表1)。

图1 LATS2及其内参在不同卵巢癌组织中的表达情况Fig 1 The expression of LATS2 mRNA in different ovarian cancer

表1 不同组卵巢组织中LATS2的表达Table 1 Expression of LATS2 mRNAin different ovarian tissue

图2 LATS2产物的溶解曲线Fig 2 Melting curves of LATS2

2.2 LATS2表达水平与临床病理特征之间的关系

LATS2在上皮性卵巢癌中、高分化组的表达量高于低分化组(P＜0.05)，在Ⅰ、Ⅱ期的阳性表达量高于Ⅲ、Ⅳ期上皮性卵巢癌组织(P＜0.01)，有盆腔淋巴结转移组的表达量低于无淋巴结转移组(P＜0.05)(表2)。

表2 LATS2在上皮性卵巢癌组织中的表达与临床及病理特征之间的关系Table 2 Relationship between the expression of LATS2 mRNAin epithelial ovarian cancer tissue and the clinicopathological characteristics

2.3 LATS2蛋白的表达

LATS2的特异性染色主要存在于上皮细胞的胞质中，极少见于核内(图3，4，5)。恶性组、良性组及正常组中的LATS2的阳性表达率存在明显差异(P＜0.01)。恶性组的LATS2表达水平低于良性组(P＜0.01)和正常组(P＜0.001)(表3)。

图5 LATS2在卵巢癌组织中的表达Fig 4 The express of LATS2 protein in ovarian cancer tissue(×200)

表3 不同组中LATS2的表达情况Table 3 Expression of LATS2 protein in different ovarian tissue

2.4 LATS2表达下调或缺失与临床病理特征之间的关系

LATS2在上皮性卵巢癌中、高分化组的阳性表达率显著高于低分化组(P＜0.01)，在Ⅰ、Ⅱ期的阳性表达率则显著高于Ⅲ、Ⅳ期上皮性卵巢癌组织(P＜0.001)，有盆腔淋巴结转移组的阳性表达率显著低于无淋巴结转移组(P＜0.01)(表4)。

3 讨论

本研究PCR结果显示LATS2在上皮性卵巢癌组织中的表达量均低于良性组和正常组，这与其他肿瘤中的表达情况类似。LATS2在乳腺癌组织中明显低于正常组织，同时在发生淋巴结转移病例中的LATS2 mRNA表达量显著下调，且与其启动子高甲基化有关［4－5］。同样在急性淋巴细胞白血病中也发现LATS2 mRNA低表达与启动子高甲基化有关，并与患者预后不良密切相关，提示LATS2低表达可能与其启动子高甲基化相关［6－7］。在恶性间皮瘤、脑胶质细胞瘤中也检测到LATS2表达下调［8－9］。此外，免疫组化结果显示LATS2在正常卵巢组织均为阳性表达，而在上皮性卵巢癌中存在的表达缺失，达(25/58)43.1%，提示LATS2的缺失有可能成为鉴别正常卵巢和上皮性卵巢癌的标记，为卵巢癌的早期诊断提供依据。另外，本实验结果显示LATS2蛋白的表达主要位于胞质，此结果与来自鼻咽癌的研究并不一致，LATS2在鼻咽癌组织中为高表达，LATS2高表达的鼻咽癌患者预后差，且LATS2主要定位于肿瘤细胞的胞核［10］。这可能是因为鼻咽癌一种与EBV感染有关的特殊头颈部恶性肿瘤，而具体的病因目前尚无统一定论，有待进一步深入研究。二者结果的不同提示LATS2在肿瘤发生中的作用具有组织特异性。

表4 LATS2在上皮性卵巢癌组织中的表达与临床及病理特征之间的关系Table 4 Relationship between the expression of LATS2 protein in epithelial ovarian cancer tissue and the clinicopathological characteristics

结合临床病理资料，统计结果显示LATS2基因的表达与年龄及病理类型无关。而上皮性卵巢癌的恶性程度越高，LATS2的表达量越低，提示了LATS2的高表达可以作为一种预后佳的标志。进一步分析LATS2的表达水平与卵巢癌患者的临床病理参数间的关系，发现LATS2的低表达水平与卵巢癌的病理分期、分化级别及转移等情况也呈负相关关系。提示LATS2可能会参与抑制卵巢癌进一步恶化及转移，其作用机制可能发生在LATS2基因序列的上游调节或其转录水平。

总之，本研究对LATS2的mRNA和蛋白表达水平与卵巢癌的关系做了初步研究，证实了LATS2的表达水平与卵巢癌的发生、恶性程度等呈负相关趋势。并为卵巢癌病情发展的预测的提供了分子水平的理论依据。

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