4.1蛋白家族成员merlin与ezrin在青海藏族胃癌中表达及对胃癌细胞功能的影响

苏占海，杨生玺，王荣华，顾 烨，马红英，孔繁花

(青海大学1.医学院生物教研室基础医学研究中心;2.附属医院肿瘤放疗科;3.医学院临床医学系，青海西宁810001)

因在其N端具有一保守结构域FERM，ezrin(埃兹蛋白)、radxin(根蛋白)、moesin(膜突蛋白)和merlin(默林蛋白)同属于4.1蛋白家族(4.1 protein family)［1－4］。Merlin 蛋白是抑癌基因神经纤维瘤 2型基因 NF2(neurofibromatosis type 2 gene，NF2)的产物，其与肿瘤的发生、发展及恶化具有相关性［5］。Merlin蛋白除扮演抑癌基因蛋白的功能外，还与ezrin蛋白参与调控细胞形态、黏附能力、细胞极化、细胞运动和细胞骨架重组，同时也参与Rho、Rac和cdc42家族成员诱导的细胞信号途径。研究发现ezrin蛋白在肿瘤中表达相对较高，提示ezrin蛋白与肿瘤的发生、侵袭等行为有关［6－12］。青海是我国胃癌高发地区，本研究拟探讨merlin和ezrin在青海藏族胃癌组织中表达特点，及对胃癌细胞BGC-823增殖与黏附侵移的影响，最终为胃癌早期诊断、治疗和胃癌发病分子机制提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 胃癌组织与正常胃黏膜组织的收集

收集2009年～2011年青海省人民医院、青海大学附属医院藏族胃癌患者手术标本，收集42例胃癌组织和37例正常胃黏膜组织;手术后病理检查按WHO(2004年)分类标准进行。所有患者标本(经患者同意后)组织均从临床手术后取材，甲醛固定、石蜡包埋，进行病理学检查和分析。

1.2 主要试剂

10X PBS缓冲液(生兴生物公司)，0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸钠缓冲液、多聚体抗兔IgG-HRP二抗、Mayor's hematoxylin(博士德生物公司)，DBA染色试剂盒、组织及血样DNA分离试剂盒、30%H2O2(博迈德公司)，兔ezrin一抗(Abcam公司)，免疫标记试剂盒、Tween、二甲苯、DNA琼脂糖、PCR纯化试剂盒、青霉素/链霉素双抗(10 g/L)(生工生物公司)，PCR Master Mix(Promega公司)，DMEM 细胞培养液(高糖)、胎牛血清(Invitrogen公司)，MTT(碧云天公司)。

1.3 PCR及DNA测序检测外显子突变

随机选择 NF2 基因外显子 2、4，7、8、12、15 和17，设计其相应引物，用于检测其突变情况，外显子引物罗列于表1。NF2各外显子PCR反应条件是95℃预变性3 min，94℃变性30 s，55～60℃复性30～60 s，72℃延伸 40～90 s，共 35个循环，最后72℃ 5～8 min。PCR产物经试剂盒纯化后，送上海生工生物公司进行测序。NF2外显子PCR扩增引物见表1。

1.4 Western blot蛋白印迹法

将目的细胞培养液吸干后，立刻加入NP-40溶液裂解细胞，提取并收集蛋白，用相应的 Western blot缓冲液处理后，将样品在99℃变性5 min，之后上样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行分析，将蛋白转膜到 PVDF膜上，并用相应的一抗(1∶800稀释)和二抗(1∶250稀释)进行处理，最终对膜上的蛋白进行Luminisence标记后进行观察。

1.5 MTT检测细胞增殖

将对数生长期胃癌细胞BGC-823以1×105/mL均匀接种于96孔培养板，每组设3个复孔，并设立空白对照组。24 h培养后，利用Lipofectamine 2000将100 μg/L重组质粒转染到细胞内。共接种5块培养板，分别培养相应的时间段。按照设定时间段将5 g/LMTT溶液20 μL加入，37 ℃ 培养4 h，之后加入150 μL DMSO，震荡混匀10 min，在酶标仪波长492 nm处检测，实验重复3次。

表1 NF2外显子PCR扩增引物Table 1 NF2 exons primer for PCR

1.6 细胞黏附侵移实验

基底膜基质包埋的96-孔板被用于细胞基质黏附能力检测实验，首先加入50 μL未含胎牛血清DMEM培养液，并在37℃孵育30 min，然后将300 μL细胞悬浮液(1×105cells/mL)接种于板中，培养12 h后利用Lipofectamine 2000进行重组质粒pcDNA3.1+FERM、pcDNA3.1+-merlin-1、pcDNA3.1+merlin-2和pcDNA3.1+ezrin以及对照载体pcDNA3.1+转染，并将细胞在37℃分别培养 6、12、24和48 h，然后利用MTT方法检测细胞黏附能力，对照组用空质粒载体pcDNA3.1+转染。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 NF2外显子在青海藏族胃癌组织中突变检测

随机选择 NF2 基因外显子 2、4、7、8、12、15 和17进行PCR及DNA测序，结果发现，在merlin蛋白基因NF2外显子17中发现突变，具体基因型为第405处碱基 T处发生 C/C、C/T型基因型;第1259处碱基C位发现T/T、C/T基因型(表2，图1，2)。

2.2 青海藏族胃癌组织和正常胃黏膜组织中ezrin蛋白表达检测

在藏族族正常胃黏膜组织中，ezrin蛋白不表达或者表达很低(图3A)，但是在胃癌组织中ezrin蛋白表达明显增加(图3B，C，D)(P＜0.05)。

表2 青海藏族胃癌组织NF2基因外显子2、4、7、8、12、15和17突变检测Table 2 Mutation summary in exon 2，4，7，8，12，15 and 17 of NF2 gene in Tibetan gastric cancer

表3 Ezrin蛋白在藏族胃癌及正常胃黏膜组织中表达Table 3 Ezrin expression in normal gastric mucosa and cancer of Qinghai Tibetan patients

在青海藏族胃癌患者中ezrin蛋白表达与组织学分型、淋巴结转移以及胃癌分化程度(高、中分化与低分化比较)有明显差异性(P＜0.05)(表4)。

2.3 Lipofectamine 2000转染重组质粒效率检测

Merlin-1、-2和 ezrin转染效果良好，间接验证Lipofectamine 2000进行转染的效果良好，FERM结构域因无单独抗体而无法直接检测(图4)。吸光度值(目标蛋白/β-actin)也显示出3种基因转染后表达相对稳定(图5)。

2.4 FERM、merlin-1、-2和ezrin蛋白对胃癌细胞增殖影响的分析

和对照组相比FERM、merlin-2蛋白对胃癌细胞BGC-823的增殖没有影响，而merlin-1和ezrin蛋白在48 h后对胃癌细胞具有一定抑制作用，其中抑癌基因蛋白merlin-1对胃癌增殖的抑制较为明显 (图6)(P ＜0.05)。

2.5 FERM、merlin-1、-2和ezrin对胃癌细胞侵移影响的检测

图3 Ezrin蛋白在青海藏族胃癌组织和正常胃黏膜组织中表达Fig 3 Immunohistochemical staining of ezrin protein expression in gastric cancer and normal gastric mucosa of Qinghai Tibetan patients(×400)

表4 Ezrin蛋白表达与青海藏族胃癌患者临床特征及病理关系Table 4 The relationship between ezrin expression and clinic characteristics of gastric patients

根据细胞基质黏附能力检测实验发现，胃癌细胞BGC-823转染FERM、merlin-1、-2和ezrin重组质粒24 h后显示，merlin-1蛋白对胃癌细胞BGC-823的黏附能力具有抑制作用(P＜0.05)(图7)，而FERM结构域、ezrin及merlin-2蛋白对胃癌细胞黏附能力没有明显作用。

图6 FERM、merlin-1、-2 and ezrin蛋白对胃癌细胞增殖的影响Fig 6 The effects of FERM、merlin-1，-2 and ezrin on the gastric cancer proliferation，n=5)

3 讨论

Merlin和ezrin蛋白共享其N-端结构域FERM，均参与细胞极化、细胞骨架重组、细胞增殖和细胞形态改变等功能。其中，而merlin蛋白存在两种主要异构体，即merlin-1和merlin-2。Merlin-1和-2在其3-末端因NF2基因转录结果不同而导致蛋白结构与功能的差异。其次，对蛋白功能研究发现，merlin-1作为抑癌基因蛋白对肿瘤细胞增殖具有抑制作用，而merlin-2蛋白没有类似的抑制作用，但是具体作用机制并未被阐明清楚［5－6，12］。

在前期研究中发现，merlin蛋白在青海藏族胃癌组织中表达水平比正常胃黏膜组织中高，且其表达与肿瘤分化程度、组织学分型和淋巴结转移有关。本研究结果显示在外显子17第405位和1 259位处分别发现突变，两个位点突变率分别为71.4%和59.5%。免疫组化结果显示，ezrin蛋白在青海藏族胃癌组织中表达比正常胃黏膜组织中较高，且ezrin蛋白表达与组织学分型、淋巴结转移以及胃癌分化程度 (高、中分化与低分化比较)具有明显差异性。因此，merlin和ezrin蛋白在青海藏族胃癌组织中的相对高表达，可能与胃癌易感性具有一定相关性。

图7 FERM、merlin-1、-2 and ezrin蛋白对胃癌细胞黏附能力的影响Fig 7 The effects of FERM，merlin-1，-2 and ezrin on the gastric cancer adhesion ability，n=5)

本研究发现，抑癌基因蛋白merlin-1和ezrin蛋白对胃癌细胞BGC-823增殖具有抑制作用，且merlin-1对胃癌细胞抑制能力更强，而FERM和merlin-2蛋白对胃癌细胞增殖无明显影响。同时，merlin-1对胃癌细胞BGC-823的黏附能力具有抑制作用，而FERM结构域、ezrin及merlin-2蛋白对胃癌细胞黏附能力没有明显作用，推测FERM结构域主要功能是连接肌动蛋白与质膜的重要结构，而对细胞增殖与黏附或侵移的调节作用极小或没有。Merlin-2虽和merlin-1同属NF2产物，但是由于其在3-端结构的不同，且没有抑癌基因蛋白功能，因此推测其C端结构域对其自身功能的实施起较为重要的作用。虽然ezrin蛋白显示其具有一定抑制胃癌细胞增殖功能，但对胃癌黏附侵移能力并没有抑制作用。因此ezrin在青海藏族胃癌组织中高表达，可能使得ezrin通过参与对细胞骨架重组、极化和细胞侵移的调节作用，从而影响胃癌细胞的侵移方向、细胞形态改变及侵移能力。综上所述，通过检测胃癌组织中merlin-1和ezrin蛋白表达水平，或许对了解胃癌发展和转移程度，以及为之后的治疗、诊断和手术提供重要的实验依据。

［1］Yogesha SD，Sharff AJ，Giovannini M，et al．Unfurling of the band 4．1，ezrin，radixin，moesin(FERM)domain of the merlin tumor suppressor［J］．Protein Sci，2011，20:2113－2120．

［2］Sun CX，Robb VA，Gutmann DH．Protein 4．1 tumor suppressors:getting a FERM grip on growth regulation［J］．J Cell Sci，2002，115:3991 －4000．

［3］Chen QY，Yan J，Hu HZ，et al．Expression of ezrin in human non-small cell lung cancer and its relationship with metastasis and prognosis［J］．Chinese journal of oncology，2012，34:436－440．

［4］ Chuan YC，Iglesias-Gato D，Fernandez-Perez L，et al．Ezrin mediates c-Myc actions in prostate cancer cell invasion［J］．Oncogene，2010，29:1531 －1542．

［5］ Gladden AB，Hebert AM，Schneeberger EE，et al．The NF2 tumor suppressor，Merlin，regulates epidermal development through the establishment of a junctional polarity complex［J］．Developmental cell，2010，19:727 －739．

［6］Gutmann DH，Hirbe AC，Haipek CA．Functional analysis of neurofibromatosis 2(NF2)missense mutations［J］．Hum Mol Genet，2001，10:1519 －1529．

［7］Jin J，Jin T，Quan M，et al．Ezrin overexpression predicts the poor prognosis of gastric adenocarcinoma［J］．Diagn Pathol，2012，7:135．

［8］Shi RL，Li JF，Qu Y，et al．［Expression of Ezrin in gastric carcinoma and its significance］［J］．Chinese journal of gastrointestinal surgery，2006，9:433－435．

［9］Yu H，Zhang Y，Ye L，et al．The FERM family proteins in cancer invasion and metastasis［J］．Front Biosci，2011，16:1536－1550．

［10］Zhang XQ，Chen GP，Wu T，et al．Expression and clinical significance of ezrin in non-small-cell lung cancer［J］．Clin Lung Cancer，2012，13196 －204．

［11］Li L，Wang YY，Zhao ZS，et al．Ezrin is associated with gastric cancer progression and prognosis［J］．Pathology Oncol Res，2011，17:909 －915．

［12］Li W，Cooper J，Karajannis MA，et al．Merlin:a tumour suppressor with functions at the cell cortex and in the nucleus［J］．EMBO reports，2012，13:204－215．