5-氮-2'-脱氧胞苷逆转膀胱癌细胞hepaCAM基因的表达及对其生长的抑制

2013-08-28潘翠翠张彦懿吴小候罗春丽

基础医学与临床 2013年1期

刘琪，潘翠翠，徐新，张彦懿，吴小候，罗春丽*

(重庆医科大学1.检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室重庆市重点实验室;2.附属第一医院泌尿外科，重庆400016)

肿瘤发生的分子机制主要有3种类型:基因突变、基因缺失和表观遗传学改变［1］。而表观遗传学改变又主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化［2］。其中DNA甲基化改变分为全基因组水平的低甲基化和 CpG岛 DNA高甲基化［3］;CpG岛的异常高甲基化主要发生于抑癌基因启动子区域。故抑癌基因在肿瘤中的失活可归结于其基因启动子区域CpG岛的异常高甲基化。

DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNMT)催化形成，是在不改变核酸序列的情况下，调节基因表达的不可逆过程［4］。5-氮-2'脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)是DNMT的抑制剂，可以逆转抑癌基因的甲基化，使其重新表达［5］。在很多其他肿瘤研究中，例如结肠癌［6］、前列腺癌［7］等，5-aza-CdR都可在一定程度上逆转抑癌基因的甲基化并抑制肿瘤生长。肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule，hepaCAM)，作为一个抑癌基因，在膀胱癌中表达低下，并且在体外研究中发现hepaCAM具有抑制膀胱癌生长的作用［8－9］。因此，本研究以hepaCAM为出发点，探究5-aza-CdR是否也能逆转hepaCAM基因在膀胱癌细胞中的表达，并与hepaCAM一起发挥抑制肿瘤生长的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌细胞T24(重庆医科大学传染病研究所惠赠)，BIU-87细胞系(武汉大学细胞库)。5-aza-CdR、MTT试剂和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);RNA提取试剂盒Trizol和RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程);PCR引物(Invitrogen公司);细胞培养基RPMI1640和新生牛血清(Gibco公司);细胞凋亡检测试剂(重庆医科大学儿研所流式细胞实验室提供)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:T24和BIU-87细胞培养于含有10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。将细胞以1×106个/孔的密度种于6孔板中，待细胞生长汇合度达到80%～90%，按照总 RNA提取步骤提取 RNA，保存于－80℃，为后续实验准备。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞增殖的影响:取对数期生长的T24和BIU-87细胞，经胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔板中，最后补充培养基至200 μL。每组设5个复孔，同时接种3个96孔板，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h。实验分为6组:T24(调零组、未处理组、0.3、1.0、3.0 和10.0 μmol/L)，BIU-87(调零组、未处理组、0.1、0.5、1.0 和5.0 μmol/L)。加药后3个板分别继续培养24、48和72 h。弃上清，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)继续培养4 h后，小心吸去上清，加入 DMSO 200 μL，振荡孵育15 min，全自动酶标仪(570 nm)检测各孔的吸光度(A值)。计算各组细胞生长抑制率，公式如下:抑制率(%)=［1－(A处理－A调零)/(A对照－A调零)］ ×100%。

1.2.3 反转录-聚合酶链反应检测hepaCAM mRNA的表达:分别用不同浓度的5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞，未用药物处理作为对照，培养24、48和72 h后收集细胞，提取RNA，用反转录试剂盒将mRNA逆转为cDNA，RT-PCR检测5-aza-CdR处理前后T24和BIU-87细胞中hepaCAM表达的变化。PCR反应条件:hepaCAM:95℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min共35个循环;72℃继续延伸5 min。β-actin:95℃预变性5 min;94℃ 变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30个循环;72℃继续延伸5 min。hepaCAM上游引物是5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'，下游引物是5'-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3'，扩增产物为461 bp。β-actin上游引物是5'-ACGAGACCACCT TCAACTCCATC-3'，下游引物是5'-TAGAAGCATTTG CGGTGGACGA-3'，扩增产物片断为307 bp。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:收集细胞，固定于70%冷乙醇(in PBS)中，4℃固定过夜，磷酸二氢盐缓冲液(PBS)洗涤，1 000 r/min离心10 min，RNase A(0.5 g/L)37℃ 消化30 min，加入 PI(50 g/L)染色，室温避光15 min，FACScan分析DNA亚2倍体的形成及细胞凋亡的变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MTT法检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞增殖的影响

5-aza-CdR呈剂量依赖性抑制了T24与BIU-87细胞的增殖。在T24与BIU-87细胞中，药物处理细胞72 h的抑制率明显高于24和48 h(P＜0.05)(图1)。

2.2 RT-PCR检测5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞后hepaCAM mRNA的表达

经5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞后，hepaCAM表达呈剂量依赖性和时间依赖性 (图2，表1，2)。

2.3 流式细胞术检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞凋亡的影响

5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞后，明显增加了凋亡细胞数，呈时间依赖性(P＜0.05)(图3)。

3 讨论

2010年，全球新增35.7万个膀胱癌病例，并有14.5万个人死于膀胱癌。90%以上的膀胱癌为移行细胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder，TCCB)，5% 为鳞状细胞癌，2% 为腺癌［10－11］。75%的TCCB为非肌肉侵袭性的，具有高复发率，且容易发展为高度恶性肿瘤［12］;而肌肉侵袭性 TCCB(25%)预后不良［13］，经过2年治疗后，50%患者会发生肿瘤转移［14］。尽管外科手术治疗，膀胱内免疫、化学治疗，以及一些新型化疗方法(如酪氨酸激酶抑制剂、抗血管生成药物等)应用于膀胱癌，但患者的生存率并未提高［14］。而在过去十几年中，众多研究都致力于寻找一种无创伤，特异性强并具有靶

向性的分子生物学治疗方法。这个工程巨大、过程复杂、冗长，所以找到一种综合性的方法，更是亟待解决的问题。

表1 5-aza-CdR作用不同时间对T24和BIU-87细胞hepaCAM mRNA的影响Table 1 The effect of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM mRNA of T24 and BIU-87 cells in different times，A value，n=4)

＊P ＜0.05 compared with blank，24 or 48 hours．

group T24(3 μmol/L 5-aza-CdR) BIU-87(5 μmol/L 5-aza-CdR)blank 0.027±0.003 0.146±0.002 24 hours 0.032±0.001 0.098±0.003 48 hours 0.036±0.002 0.104±0.000 72 hours 0.716±0.008* 0.536±0.002*

表2 72 h时不同药物浓度的5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞hepaCAM mRNA的影响Table 2 The effect of different concentrations of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM of T24 and BIU-87 cell lines for 72 hours，A value，n=5)

#P ＜0.05 compared with blank or 0.3 or 1.0 μmol/L 5-aza-CdR;*P ＜0.05 compared with blank or 0.1 or 0.5 or 1.0 μmol/L 5-aza-CdR．

group T24 group BIU-87 blank 0.030±0.000 blank 0.196±0.002 5-aza-CdR 5-aza-CdR 0.3 μmol/L 0.028 ±0.001 0.1 μmol/L 0.197 ±0.006 1.0 μmol/L 0.037 ±0.002 0.5 μmol/L 0.178 ±0.002 3.0 μmol/L 0.164 ±0.008# 1.0 μmol/L 0.147 ±0.028 10.0 μmol/L 0.201 ±0.002# 5.0 μmol/L 0.647 ±0.007*

图3 流式细胞技术检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞凋亡的影响Fig 3 The effect of 5-aza-CdR on apoptosis of T24 and BIU-87 cell lines was detected by FCM

5-aza-CdR是一种去甲基化药物，可以抑制抑癌基因的甲基化，使众多抑癌基因重新表达。迄今已有临床Ⅰ，Ⅱ期试验证实，在实体瘤中，如卵巢癌、雄激素依赖的前列腺癌、子宫颈癌等，5-aza-CdR难以达到预期的有效治疗作用，后续的药物效力仍在研究中;在血液的恶性肿瘤临床Ⅰ，Ⅱ期实验中，5-aza-CdR单剂量就对急性白血病有疗效，对进展中的慢性粒细胞白血病有中等的疗效［7］。但5-aza-CdR在膀胱癌中的研究和应用甚少，故本研究先从体外实验出发，用不同浓度的5-aza-CdR处理膀胱癌T24和BIU-87细胞，发现5-aza-CdR可以抑制体外膀胱癌细胞的增殖，并可促使细胞凋亡;另一方面，从抑癌基因hepaCAM角度出发，发现5-aza-CdR可使hepaCAM基因重新表达。hepaCAM自2005年发现以来，一直都在研究其结构和功能［8－9］，至于它在肿瘤组织中表达低下或缺失的原因研究较少。本研究发现5-aza-CdR可逆转 hepaCAM基因表达，而5-aza-CdR又是DNA甲基转移酶的抑制剂，可逆转抑癌基因的甲基化，那么5-aza-CdR使hepaCAM重新表达的原因是否会由于5-aza-CdR逆转了抑癌基因hepaCAM的甲基化;5-aza-CdR对膀胱癌细胞的抑制作用也是否也源于hepaCAM基因的重新表达，或者是其单纯的抑制作用，又或者有两种机制一起作用，这些问题都需要进一步的研究。然而，5-aza-CdR应用于膀胱癌，可使很大一部分的抑癌基因得到重新表达，从另个方面又增强了抑制肿瘤生长的作用，故设想若结合精确的手术治疗，常规化疗，以及新型的药物治疗，比如5-aza-CdR，可能会给膀胱癌治疗带来新的前景。

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