环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用

肖维威，周琳华，郑文岭，马文丽

(南方医科大学基因工程研究所，广东广州510515)

随着生物医药科学的迅猛发展，检测技术越来越受到重视。核酸扩增是生命科学中最重要的检测手段之一，目前已广泛应用于临床医学诊断和传染病病原体检测等领域。核酸扩增技术主要分为以常规PCR为基础的变温扩增技术以及恒温扩增技术两大类。常规PCR包括单一PCR、多重PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等，恒温扩增技术包括核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NABSA)、滚环DNA扩增(rolling circle DNA amplification，RCA)、指数式扩增反应(exponential amplification reaction，EXPAR)、连接酶链扩增反应(ligase chain reaction，LCR)、链置换扩增反应(strand displacement amplification，SDA)和环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)技术等。因PCR的变温过程使其对仪器精密度要求较高，操作时间相对较长，从而导致PCR无法推广至基层。因此，恒温扩增成为核酸扩增技术的一个研究热点，环介导等温扩增技术就是其中一种。

环介导等温扩增技术又称为环介导恒温扩增技术，是由Notomi等［1］于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。凭借其高效、快速、特异、低廉、易检测、易操作等特点，从问世以来，短短十几年，即在各种病原体、病毒快速检测、动植物检疫等方面崭露头角，尤其在传染性疾病诊断中发挥了极大作用。随着该技术体系的完善与发展，其在分子检测领域的应用也必将越来越广泛与深入。

1 LAMP技术的原理

1.1 LAMP的技术原理

LAMP技术针对靶序列的6个特异性区域设计2对引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温30～60 min，即可扩增出109拷贝靶序列，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸镁沉淀产生。

1.2 引物组成

LAMP的2对引物分别称为FIP、BIP、F3和B3，可识别靶基因的6个不同区域。F3:上游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。B3:下游外部引物，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。FIP:上游内部引物，由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3'端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5'端的Flc区域序列相同，两者之间以TTTT连接。BIP:下游内部引物，由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补，B1c区域与靶基因5'端的Blc区域序列相同，两者之间以TTTT连接(图1)。

1.3 引物设计原则

由于LAMP是通过2对引物与6个不同区域的相互识别来产生扩增效应，因此引物设计要求比较高。LAMP引物设计一般选取一段长约130～200 bp(最长300 bp，不可超过500 bp)的保守序列作为靶序列。引物设计需要遵循以下原则:1)要保持引物的退火温度约55～66℃，其中F1c和B1c的Tm值最高(64～66℃)，F2和B2次之(59～61℃)，F3和B3最低(55～60℃);GC含量高者，取Tm范围较高值;而AT含量高者，取Tm范围较低值。2)B1c、F2和F3与靶保守序列(5'→3'方向)的相应部分相同，F1c、B2和B3与靶保守序列的相应部分反向互补。3)F2的前端与B2之间相距120～180 bp，F2的前端与F3及B2的前端与B3之间相距0～20 bp，F2的前端与F1c及B2的前端与B1c之间相距40～60 bp。4)避免引物二级结构形成，特别是3'端不应存在富AT区，不能与其他引物互补。5)GC含量在40% ～65%之间，以50% ～60%为最佳。

具体设计时，采用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer 3.0(或4.0)http://primerexplorer.jp/e，并结合DNAstar的MegAlign模块和Primer 5.0对引物进行综合比较，防止产生引物二聚体。还可以利用在线BLAST，将设计好的引物在Gen-Bank中进行比对确认，以保证引物的特异性。

2 LAMP技术的特点

LAMP之所以被很多科学家认为可以替代PCR技术在于其有几大突出特点:

2.1 高效性

LAMP反应不需要双链DNA的预热变性，避免了温度循环造成的时间损失。核酸扩增一般在1 h内均可完成。在稳定的体系中添加环引物后，时间更可以缩短到原来的1/2，多数情况在20～30 min即有扩增产物可被检测。这对于快速诊断十分重要，便于患者即时获得临床检验结果，医生及时决定治疗方案。

图1 LAMP引物设计示意图Fig 1 The schematic diagram of LAMP primers

2.2 高灵敏性

与定性PCR相比，LAMP法的检测率要比其高出1～2个数量级，具有real-time TaqMan PCR同样的敏感性，能满足低拷贝数样品的检测，扩增产物靶序列可达到109以上。有研究［2］发现，加环引物的敏感性要比没有加环引物的高出7个数量级，在极低模板量(0.01 PFU)即可获得结果。

2.3 高特异性

由于是针对靶序列6个区域设计4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。

2.4 操作简单

扩增结果判定不需要对产物进行电泳，而可直接用肉眼观察扩增管浊度，或通过向其扩增产物中添加荧光染料再通过颜色变化来判定结果，使结果可视化，操作更简单。

2.5 成本低廉

LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要恒温水浴锅即可，不需要特殊的试剂及仪器，适合大规模筛检和基层疾病检测。

3 LAMP法的进展

鉴于LAMP技术相比于其他核酸扩增方法具有以上多种优点，人们在许多方面对其更进行了改进和研究，使其更加简便快速，以便更适于临床检测的要求。LAMP法的进展主要包括:

3.1 检测模板的拓展

除对DNA检测外，LAMP也可对RNA分子进行检测。RT-LAMP的扩增原理与LAMP相同，只是在反应体系中增加了反转录试剂，使RNA的反转录和LAMP扩增在同一试管中完成，而不需要分步进行［3－5］。2008 年，Kelly 等［6］研究发现，LAMP 法对模板要求不高，可直接用于某些病原微生物样本的检测，而无需对样本中的核酸进行提取纯化，这使LAMP技术在临床应用中更加简便［7］。

3.2 反应速度改进

LAMP是恒温扩增，没有温度变化的时间损耗，一般60～90 min即可完成扩增反应，能基本满足临床病原微生物快速检测的要求，但相比临床常用的ELISA等免疫学技术，所需时间还是较长，因此人们进行了加快反应速度的研究。2005年，Yoshida等［2］通过在反应体系中添加2条环引物的方法使反应速度大大提高，反应时间缩短一半，在30 min内即可完成反应。

3.3 产物鉴定方法

对于LAMP扩增产物的检测通常有3种方法:1)经琼脂糖电泳，EB染色观察梯度条带。LAMP反应中的产物是一系列具有不同茎长度的茎环结构DNA和带有许多环的类似花椰菜结构的DNA混合物，因此当用凝胶电泳分析时，会产生特异的梯状条带。2)肉眼观察。在产物中加入SYBR GreenⅠ，变成绿色说明有扩增产物，没有变色说明无扩增产物。3)间接通过对LAMP扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀形成的浑浊程度进行判断。目前，这种方法已被改进并成功开发出一种实时浊度检测仪［8］，它也可以用于对靶序列进行定量分析。

3.4 与其他技术联合应用

LAMP技术在建立之后，人们利用其敏感、简便、快速的特点，将其与其他的技术进行联合，开发了很多有效的检测方法。2004年，Hataoka等［9］将LAMP法与电泳结合，制成聚丙烯酰胺凝胶基因芯片，用来检测和分析特异性基因类型。2003年，Maruyama等［10］把LAMP和原位杂交相结合，建立原位LAMP(in-situ LAMP)，用于检测组织细胞中大肠杆菌O157∶H7。2006年申建维等［11］在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，将核酸杂交和LAMP技术进行结合，用多重LAMP同时扩增金黄色葡萄球菌耐药基因mecA和femA。结果该方法的最低检测限为10 CFU/mL，与药敏试验结果相比较，灵敏度为99.0%，特异性为90.9%，证明该方法灵敏度高，特异性强，操作简便快速，适用于临床病原微生物的快速检测。

4 LAMP在病原微生物检测中的应用

4.1 细菌的检测

首先将LAMP用于细菌检测的是Maruyama等［10］，他们用该技术成功检测了大肠杆菌O157∶H7细胞中stxA2基因。Maed等［12］针对引起牙龈炎的病原菌16S rRNA基因建立了LAMP技术，可在30 min内检测出含有20个细菌的扩增子，产物不需要进行电泳，只要向扩增产物中添加荧光染料SYBY GreenⅠ，通过肉眼观察直接判定结果，是一种诊断口腔传染性疾病的有效快速诊断方法。朱杰仪等［13］根据不同血清型副猪嗜血杆菌的16S rRNA高度保守区域，建立了LAMP检测方法，反应可在1 h内完成，比PCR敏感100倍。目前LAMP还成功地用于特异检测炭疽芽孢杆菌［7］、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌［11］、霍乱弧菌［14］、肺炎链球菌［15］等细菌类病原微生物。通过对众多细菌研究结果表明，与传统PCR相比，LAMP技术不仅快速、敏感，而且具有良好的特异性。

4.2 病毒的检测

Enomoto等［16］及 Kaneko 等［17］采用 LAMP 方法扩增7型人类疱疹病毒(HHV-7)DNA，并采用焦磷酸镁浊度法进行检测。结果反应30 min后LAMP的检测灵敏性为每管500拷贝，60 min的灵敏性为每管250拷贝，而HHV-6A、HHV-6B和巨细胞病毒(HCMV)均未出现扩增反应。自用LAMP成功地检测了人类疱疹病毒之后，又用LAMP对单纯疱疹病毒［18］、水痘带状疱疹病毒［19］、乙肝病毒［20］实现了检测。

在同一反应管中加入反转录酶和DNA聚合酶，还可以对RNA病毒进行RT-LAMP扩增检测。2009年Hosaka等［21］利用RT-LAMP对HIV-1M组进行检测，扩增反应在35 min内即可完成，检测限达到120拷贝/mL。从57名感染HIV-1的患者和40名未感染HIV-1的居民体内收集血浆样品进行RT-LAMP分析，结果与预期完全一致。由此可见，RT-LAMP分析在HIV诊断上快速灵敏，尤其适用于资源条件不足的环境。此外，对狂犬病病毒［22］、日本乙型脑炎病毒［23］、马尔堡病毒［24］、禽流感病毒［25］等进行 RT-LAMP 检测的方法也已建立起来，并得到不断深入的研究。

4.3 寄生虫的检测

原生动物寄生虫是人类重要而常见的病原体，严重危害人类健康。基于LAMP技术的特点，其在原生动物寄生虫检测方面也得到了广泛应用。2012年易海华等［26］针对感染人的4种疟原虫(恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫)的18S rRNA基因共有保守序列，建立了定量的环介导等温扩增基因检测方法。该法可特异区分检测上述4种疟原虫与12种相关寄生虫，与PCR方法相比，LAMP检测方法的敏感性是其10倍，检出限达到1.42×101拷贝/μL，适合疟疾防治检测的需要。目前 LAMP 还广泛地应用于锥虫［27］、弓形虫［28］、血吸虫［29］等的检测。

5 展望

目前LAMP技术的研究主要集中在产物检测的方便性和反应速度上，各国科技工作者都在努力提高反应速度、缩短反应时间、找到简便的产物检测方法，以更好地应用于基层临床诊断和现场检测。凭借其操作简单、特异性强、可以在短时间内快速获得大量特异性扩增产物、扩增产物易判断、不需要昂贵的仪器和试剂等优点，LAMP技术非常适用于临床即时、快速简便的大样本量检测要求，必将成为核酸研究领域的重要工具，在病原微生物检测领域有着非常广泛的应用前景。

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