Fzr1基因沉默促进滋养层细胞的侵袭与增殖

张保平，钟 婷，张 莉，况海斌

(南昌大学医学院生理学教研室，江西南昌330006)

胚胎的正常发育依赖于功能性胎盘的形成，在胎盘发育的过程中，滋养层细胞的生长与侵袭受机体严格的时空性调节［1］。在妊娠早期，如滋养层细胞生长发育差，侵入不足，将导致早期流产、先兆子痫以及胎儿宫内发育迟缓等疾病［2］;如增生过度、侵入失控，正常滋养层细胞将转化为绒毛膜上皮癌［3］，而有关其具体的调节过程不详。

细胞周期末期促进复合物(anaphase promoting complex，APC)与其调节亚基Fzr1是泛素蛋白酶小体系统中的一种细胞内泛素连接酶E3，在增殖细胞中通过泛素化，降解特定的底物蛋白调控细胞周期的作用［4］。最近有研究显示，Fzr1基因敲除后，在妊娠9.5～10.5 d产生胚胎死亡，胎盘出现发育障碍［5－6］。另外，还表现为神经系统的干细胞增殖增强，自发性肿瘤(如乳腺瘤，脂肪腺瘤，睾丸癌，纤维腺瘤，肺癌等)的发生率明显增加［5－6］。这些均提示，Fzr1基因与胎盘发育相关，然而有关其在胎盘发育过程中时空性表达变化及其对滋养层细胞增生和侵袭的影响未见相关的报道。本研究拟探讨Fzr1对JAR滋养层细胞增殖和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

FD培养基(Hyclone公司)，Matrigel(BD公司)，兔抗 Fzr1抗体(Invitrogen公司)，抗 Actin抗体、Fzr1 siRNA(sc-44349)、siRNA Transfection Reagent(sc-29528)及Control siRNA(sc-36869)(SANTA CRUZ公司)，HRP标记的二抗(中杉生物公司)。

1.2 妊娠早期和晚期胎盘标本

人妊娠早期(6～9周)绒毛样本(共20例)，取自正常妊娠的真空负压抽吸人工流产材料，妊娠晚期胎盘取自妊娠足月(34～38周)胎盘(共15例)。标本取出后，立即送实验室，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液清洗，一部分材料固定于Bouin's氏液中，用于免疫组化。另外一部分标本暂贮存于－80℃，用于免疫印迹检测。所有标本均来自于南昌大学第一附属医院，且获得该单位伦理委员会的批准和患者的知情同意。

1.3 细胞培养及RNA干扰

JAR滋养层细胞系(上海细胞库)培养于FD培养液中，细胞以2×105个/孔种植于6孔培养板中，当细胞长至60% ～80%汇合时，用于Fzr1 RNA干扰。转染开始时，溶液A的制备:取8 μLsiRNA加入到100 μL siRNA Transfection Medium;溶液B 的制备:取 8 μL siRNA Transfection Reagent加 入 到100 μL siRNA Transfection Medium，然后100 μL溶液A 和100 μL溶液B 混合，室温孵育30 min，用2 mL的siRNA Transfection Medium洗JAR滋养层细胞1次，然后加入0.8 mL siRNA Transfection Medium到孵育后的溶液A和B的混合液中，混匀，轻轻覆盖于细胞，37℃孵育细胞5～7 h，清洗后细胞用于MTS和Transwell实验，分为空白对照组(仅加入相应剂量的培养液)、无义干扰对照组(加入control siRNA)和Fzr1干扰组(加入Fzr1 siRNA)。

1.4 MTS法检测细胞增殖

细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为5×105个/mL，细胞悬液接种于96孔培养板;每孔培养液总量100 μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，后加入 MTS 20 μL，37 ℃ 1 h。然后用分光光度度计在490 nm波长测定其A值。

1.5 Transwell小室检测滋养层细胞侵袭能力

侵袭小室上层预铺上Matrigel，细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至2×105个/mL。取200 μL细胞悬液加入Transwell上室，在小室底端加入800 μL含10% 胎牛血清的培养液，作为趋化剂。常规培养24 h后，用棉签擦去上室滤膜上的细胞，再用手术刀将膜切下，置于1∶1甲醇和丙酮中室温固定10 min，后用苏木素染核。再将膜贴于玻片上，滴上DABCO液，盖上盖玻片，然后再在Nikon正置显微镜下进行观察和拍照，随机采用3～5个视野，计算迁移至滤膜背面的细胞数。

1.6 免疫组织化学

将上述处理的绒毛和胎盘标本固定于Bouin's氏液中，经逐步脱水后包埋于石蜡中。组织切片经脱蜡、水化，浸入含3%H2O2中10 min及5%BSA室温封闭30 min，再将切片加入兔抗人Fzr1一抗(1∶500)4℃过夜。切片经过PBS冲洗3次后，加入的HRP标记的二抗，后用DAB方法显色。

图1 免疫组化分析Fzr1蛋白在胎盘的定位Fig 1 Immunohistochemical localization of Fzr1 protein in human placenta

1.7 免疫印迹

组织样品置于800 μL细胞裂解液(RIPA)充分裂解，然后在4℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清，以BCA法测定蛋白质含量。每孔上样40 μg，蛋白样品经过12%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，随后在5%脱脂奶粉/TBST中(pH 7.4)室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜。随后用HRP标记的二抗于室温孵育1 h，采用化学发光(ECL)方法进行显色，经X线片曝光得到特异条带。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Fzr1蛋白在正常妊娠胎盘的时空性表达

在妊娠早期，Fzr1蛋白强烈表达于绒毛的细胞滋养层和合体滋养层细胞，阳性信号主要位于胞质(图1A，D)。在妊娠晚期，Fzr1蛋白主要表达于绒毛的合体滋养层细胞，且表达量明显下降，阳性信号主要在细胞核(图 1B，E)。与妊娠早期相比(0.83±0.12)，妊娠晚期Fzr1蛋白的相对吸光度值明显下降(0.17±0.09，P ＜0.01)(图2)。

2.2 Fzr1基因的干扰对JAR滋养层细胞侵袭能力的影响

图2 Western blot检测Fzr1蛋白在妊娠早期和晚期胎盘的表达Fig 2 Western blot analysis of Fzr1 protein expression in the placenta of first and third trimester

图3 Transwell分析Fzr1 siRNA对JAR细胞侵袭的影响Fig 3 Effect of Fzr1 siRNA on the invasion of JAR cell by Transwell analysis(×200)

与空白对照相比，Fzr1干扰组，JAR细胞的侵袭能力明显增强(P＜0.01)(图3A，C，D)，而无义对照，没有明显变化(图3B，D)。

2.3 Fzr1基因的干扰对JAR滋养层细胞增殖能力的影响

与空白对照相比，Fzr1干扰组，JAR细胞的增殖能力明显增强(P＜0.01)，而无义对照，没有明显变化(图 4)。

图4 MTS分析Fzr1 siRNA对JAR细胞增殖的影响Fig 4 Effect of Fzr1 siRNA on the proliferation of JAR cell by MTS analysis

3 讨论

在正常情况下，细胞的生长依赖于细胞周期调控蛋白的激活与降解，而其降解主要是通过泛素化途径来实现的［4］。机体内有两种泛素-蛋白连接酶:SCF复合物(Skp1/Cullin/F-box protein complex，SCF)和APC［3］。其中APC与Fzr1蛋白结合才具有活性，激活的APC依赖泛素化降解周期蛋白B和其他蛋白质，使M期激酶失活，从而调控细胞周期的进展。Fzr1基因的缺失或插入研究显示，Fzr1基因与胎盘的生长分化密切相关［6－7］，故本研究首先检测了Fzr1蛋白在妊娠早晚期表达变化。在妊娠早期，Fzr1蛋白强烈表达于绒毛的细胞滋养层和合体滋养层细胞，且表达水平比较高，至妊娠晚期，Fzr1蛋白的表达量明显下降，这一点与García-Higuera I等［6］对Fzr1 mRNA水平的研究相一致。

在妊娠的早期，绒毛的滋养层细胞具有高度的增殖能力和侵袭的特性，有利于绒毛组织在妊娠早期形成具有功能的胎盘和侵入子宫内膜［3］。这一过程严格而又精细，受许多因素的调控［3，8－9］。滋养层细胞增殖障碍或过度、浸润过深或过浅，常导致各种疾病出现［1，3］。Fzr1蛋白在妊娠早期表达水平高，且已有的研究显示其与细胞生长相关［5－6］，提示其可能与滋养层细胞的增殖和侵袭有关。通过RNA干扰实验研究显示，Fzr1基因具有明显抑制滋养层细胞增殖和侵袭，有利于妊娠早期防止滋养层细胞过度增殖和侵入子宫内膜，防止绒癌、葡萄胎等疾病的发生。至妊娠晚期，正常的滋养层细胞的增殖和侵袭能力明显下降，相应的Fzr1蛋白表达水平明显下降。

Fzr1蛋白对滋养层细胞的抑制作用可能与S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)的降解相关［10］。在增殖细胞中，Fzr1蛋白与APC形成复合物，通过泛素化降解Skp2蛋白的表达，稳定P27和P21的水平，抑制细胞增殖［10］。另外，APC也可通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β )抑 制 细 胞 增 殖［10－11］。TGF-β是一类调节细胞生长与分化的多肽，对于滋养层细胞的生长和侵袭具有明显的抑制作用［12］。Fzr1蛋白对于滋养层细胞的增殖和侵袭的调节是否通过TGF-β来实现，有待于进一步研究。

目前研究发现，子痫前期、流产、早产、胎儿宫内发育迟缓以及绒癌和葡萄胎发生均与妊娠早期滋养层细胞增殖和侵袭相关［1－3］。在上述疾病中，Fzr1蛋白表达量及表达部位是否发生改变及其作用机制，还有待于进一步研究，从而有利于阐明这些疾病的发病机制和寻找到新的治疗靶点。

［1］Huppertz B，Berghold VM，Kawaguchi R，et al．A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion ［J］．Am J Reprod Immunol，2012，67:349－357．

［2］Hogeveen M，Blom HJ，den Heijer M．Maternal homocysteine and small-for-gestational-age offspring:systematic review and meta-analysis［J］．Am J Clin Nutr，2012，95:130－136．

［3］Ferretti C，Bruni L，Dangles-marie V，et al．Molecular circuits shared by placental and cancer cells，and their implications in the proliferative，invasive and migratory capacities of trophoblasts［J］．Hum Reprod Update，2007，13:121－141．

［4］McLean JR，Chaix D，Ohi MD，et al．State of the APC/C:organization，function，and structure［J］．Crit Rev Biochem Mol Biol，2011，46:118 －136．

［5］Asakawa H，Kitamura K，Shimoda C．A novel Cdc20-related WD-repeat protein，Fzr1，is required for spore formation in Schizosaccharomyces pombe［J］．Mol Genet Genomics，2001，265:424－435．

［6］Garcia-higuera I，Manchado E，Dubus P，et al．Genomic stability and tumour suppression by the APC/C cofactor Cdh1［J］．Nat Cell Biol，2008，10:802 －811．

［7］Stemmler MP，Bedzhov I．A Cdh1HA knock-in allele rescues the Cdh1－/－ phenotype but shows essential Cdh1 function during placentation［J］．Dev Dyn，2010，239:2330－2344．

［8］辛虹，郑丽丽，王惠兰．AnnexinⅤ在低氧滋养细胞中的表达下调［J］．基础医学与临床，2011，31:1383－1386．

［9］吴弘，郎希龙，仲伟国，等．妊娠高血压综合征患者胎盘组织细胞分化相关基因表达的变化［J］．基础医学与临床，2005，25:209 －213．

［10］Hu D，Liu W，Wu G，et al．Nuclear translocation of Skp2 facilitates its destruction in response to TGFβ signaling［J］．Cell Cycle，2011，10:285－292．

［11］Hu D，Qiao X，Wu G，et al．The emerging role of APC/CCdh1 in development［J］．Semin Cell Dev Biol，2011，22:579－585．

［12］Jones RL，Stoikos C，Findlay JK，et al．TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta［J］．Reproduction，2006，132:217－232．