贴敷后祖师麻膏药中祖师麻甲素和7-羟基香豆素的残留量测定

李 爽， 石晓峰，*， 范 彬， 白朝辉

(1.甘肃中医学院，甘肃兰州 730030;2.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州 730050)

祖师麻膏药 (国药准字Z62020522)为国家中药保护品种，收载于《部颁标准中药成方制剂第十八册》(标准号:WS3-B-3456-98)，由祖师麻提取精制的浸膏粉和武威膏药组成［1］。主药祖师麻药材含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类等化学成分［2-3］。有关采用高效液相色谱法 (HPLC)研究祖师麻药材指纹图谱［4-5］及其主要有效成分祖师麻甲素 (7，8-二羟基香豆素，又称瑞香素，Daphnetin)、7-羟基香豆素 (伞形酮，又称伞形花内酯，7-Hydroxycoumarin)、紫丁香苷 (syringin)定量测定的方法已有文献报道［6-10］，对祖师麻膏药中祖师麻甲素和紫丁香苷测定的HPLC法也有文献报道［11-12］。为了评价祖师麻膏药的透皮吸收效果，本实验采用高效液相色谱法，建立了同时测定祖师麻膏药中祖师麻甲素和7-羟基香豆素的方法，并通过对祖师麻膏药贴敷前后祖师麻甲素和7-羟基香豆素的测定，考察贴敷后祖师麻膏药的药物残留率，希冀为祖师麻膏药的使用和二次开发提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1120型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司);AE260型万分之一电子天平 (瑞士Mettle Toledo公司);CP225D型十万分之一电子分析天平 (德国Sartorius公司);SHZ-D型循环水式真空泵(河南巩义市予华仪器有限责任公司);SK3310HLC型超声波清洗器 (上海科导超声仪器有限公司);766型远红外快速干燥箱 (江苏省南通县金余电器配件厂)。

1.2 试药

祖师 麻 膏 药 (10 g/张，批 号:20090809、20111118)由甘肃泰康制药有限责任公司提供;对照品祖师麻甲素 (供定量测定用，批号:110900-200405)、7-羟基香豆素 (供定量测定用，批号:111739-200501)均由中国食品药品检定研究院提供;甲醇 (色谱纯，批号:20110627012)、乙腈(色谱纯，批号:2010100102)均由西陇化工股份公司提供;水为重蒸水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取祖师麻甲素对照品4.20 mg和7-羟基香豆素对照品2.50 mg，各置25 mL量瓶中，加40%乙醇溶解并定容，分别配制成每1 mL含祖师麻甲素0.168 mg、7-羟基香豆素0.100 mg的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 除去背衬刮取膏药上的药物，精密称取0.5 g，置50 mL圆底烧瓶中，加入40%乙醇10 mL，称定质量，回流提取1 h，放置室温后称定质量，用40%乙醇补足减失质量，过滤。滤渣加入40%乙醇10 mL，称定质量，回流提取1 h，放置室温后用40%乙醇补足减失质量，过滤，滤渣再加入40%乙醇2 mL冲洗，合并滤液和冲洗液，蒸干，残渣用40%乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按祖师麻膏药生产工艺制备不含祖师麻浸膏粉的样品，依2.1.2项下操作制成阴性对照溶液。

2.2 香豆素成分测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 Agilent E-clipse Plus C18色 谱 柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相为乙腈 －0.1%磷酸水溶液(15∶85);体积流量1.0 mL/min;检测波长327 nm;柱温30℃;进样量20 μL。分别精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色谱仪，依上述优化色谱条件进样测定。结果样品中祖师麻甲素、7-羟基香豆素均得到较好分离，与其相邻色谱峰分离度大于1.5。理论塔板数以祖师麻甲素和7-羟基香豆素峰面积计算不得低于3 000。见图1。

图1 对照品 (A)，阴性样品 (B)和供试品 (C)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，negative sample(B)and sample(C)

2.2.2 线性关系的考察 分别精密吸取祖师麻甲素对照品溶液 100、150、200、250、300、350、400 μL和7-羟基香豆素对照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μL至1 mL量瓶中，用40%乙醇稀释至刻度摇匀，制得系列质量浓度的混合对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各20 μL，依次进样测定峰面积。以质量浓度 (Y，μg/mL)为纵坐标，峰面积 (X)为横坐标进行线性回归。

祖师麻甲素回归方程:Y=1.126 48×10－6X－0.036 11(r=0.999 1)，线性范围 16.8～67.2 μg/mL。7-羟基香豆素回归方程:Y=7.595 17×10－7X－1.663 73(r=0.999 1)，线性范围5～60 μg/mL。

结果表明，祖师麻甲素和7-羟基香豆素在各自的质量浓度范围内与峰面积的积分值呈良好线性关系。

2.2.3 精密度试验 精密吸取祖师麻甲素对照品溶液 300 μL、7-羟基香豆素对照品溶液 400 μL，于1 mL量瓶中，加40%乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成祖师麻甲素、7-羟基香豆素质量浓度分别为50.4 μg/mL、40 μg/mL 的混合对照品溶液。精密吸取该对照品溶液20 μL，按上述液相色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，结果祖师麻甲素、7-羟基香豆素峰面积积分值的RSD分别为1.33%和1.25%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 精密称取样品0.5 g(批号:20090810)，按2.1.2项下操作制得供试品溶液，依上述色谱条件，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进样20 μL，测定峰面积，求得祖师麻甲素、7-羟基香豆素峰面积积分值的 RSD分别为2.58%和2.10%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 重复性试验 精密称取同一批祖师麻膏药0.5 g(批号:20090810)，共6份，按2.1.3项下操作制得供试品溶液，按上述色谱条件，进样20 μL测得祖师麻甲素的平均质量分数和RSD分别为0.691 0 mg/g和1.51%，7-羟基香豆素的平均质量分数和RSD分别为0.677 0 mg/g和1.48%，结果表明该方法重复性较好。

2.2.6 加样回收率试验 精密称取已知量 (批号:20090810)样品约0.3 g，共9份，按样品含有量的80%、100%和120%分别加入祖师麻甲素和7-羟基香豆素对照品溶液，按2.1.2项下操作制得供试品溶液，依上述色谱条件下进样20 μL，测定峰面积，计算结果见表1，祖师麻甲素和7-羟基香豆素的平均加样回收率分别为100.58%(RSD=1.62%)和100.53%(RSD=1.74%)。

表1 加样回收率试验结果(n=3)Tab.1 Results of recovery test(n=3)

2.3 贴敷后祖师麻膏药中祖师麻甲素、7-羟基香豆素的残留量测定

6名健康志愿者，签署知情同意书后分别在背部贴敷祖师麻膏药 (批号:20111118，祖师麻甲素和7-羟基香豆素的平均质量分数分别为1.217 8 mg/g、0.738 4 mg/g)3贴，于24、48、72 h各揭帖1张，编号后，除去背衬刮取膏药上的药物，撕碎，备用。按2.1.2项下操作制得供试品溶液，按上述色谱条件下，进样20 μL测定峰面积，计算祖师麻膏药贴敷不同时间后祖师麻甲素、7-羟基香豆素的残留量。依下列公式计算祖师麻膏药贴敷后祖师麻甲素、7-羟基香豆素的残留率，结果见表2。

由表2可知，贴敷24、48、72 h后的祖师麻膏药中祖师麻甲素和7-羟基香豆素的平均残留率分别为 69.45%、53.12%、30.00%和 93.23%、88.28%、86.74%。

表2 祖师麻膏药贴敷不同时间后祖师麻甲素和7-羟基香豆素的残留量和残留率Tab.2 Residual amount and residual rate of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in Zushima Plaster used for different time

3 讨论

选用文献报道的流动相如甲醇－0.5%醋酸水溶液 (25 ∶75)［6］、甲醇 －0.5% 磷酸水溶液(20 ∶80)［7］、乙 腈-水 (30 ∶70)［8］、 乙 腈-水(8∶92)［11］分别考察祖师麻甲素和7-羟基香豆素的分离效果与色谱峰对称性，结果均不理想。而采用乙腈－0.1%磷酸水溶液 (15∶85)为流动相，祖师麻甲素、7-羟基香豆素的色谱峰的对称性和分离度均较好，达到理想的分离效果。

分别选用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇作为提取溶剂对祖师麻膏药进行回流提取，以祖师麻甲素、7-羟基香豆素的提取率为考察指标，发现40%乙醇作为提取溶剂提取效率较高，故以其为提取溶剂。

文献［13］报道，祖师麻膏药贴于人体使用24 h后，药布上残留的香豆素类成分占使用前的90%左右，贴48 h后有效成分仍残留80%，表明膏药中部分有效成分未被吸收。但是实验中测得6名志愿者贴敷24、48、72 h后的祖师麻膏药中祖师麻甲素和7-羟基香豆素的平均残留率分别为69.45%、53.12%、30.00%和93.23%、88.28%、86.74%，说明祖师麻膏药中主要有效成分香豆素类的透皮吸收率存在明显差异，这可能与其化学结构中的羟基数量有关。

由于使用后祖师麻膏药有效成分的残留较多，使用时可反复揭贴使用多次。考虑到使用后祖师麻膏药中有效成分香豆素类的残留较高，可添加适当的透皮促进剂使其发挥更大的药效。

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