NMDA受体NR2A亚基在脑缺血后处理中的保护作用

张 茜 涂静宜 朱 莹 唐 慧 王瑞敏

(河北联合大学医学实验研究中心神经生物学研究所 河北唐山 063000;①唐山职业技术学院病理教研室)

随着人口老龄化的发展，脑中风在我国的发病率及致残率逐年增加，严重增加了人们的生活负担[1]。对脑中风的研究，最多集中在兴奋性谷氨酸受体上。其中，NMDA受体是大家公认的在缺血性脑中风中起重要的作用的离子型谷氨酸受体[2]。NMDA 受体是由3 种亚基构成的:NR1、NR2、NR3[3]。NR1 亚基是其结构亚基，NR2亚基是其调节亚基。NR2亚基又分为NR2A－NR2D亚基[4]。有报道证实，NR2A亚基可以诱导长时程增强[5];我们最近的研究证明，脑缺血后处理具有神经保护作用[6]。那么，在缺血后处理中，NR2A是否可介导其保护作用尚未见报道，本实验主要研究NR2A亚基在脑缺血后处理中的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级成年雄性SD大鼠，体质量250～300g，由北京维通利华实验动物中心提供，动物合格证号[SCXK(京)2006－0009]。NR2A一抗(sc－1468)和相应的驴抗羊二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)，Cadherin由美国Brann教授赠送，NR2A特异性抑制剂NVPAAM077由瑞士Yves Auberson教授友情赠送;焦油紫购自美国Sigmaaldrich公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞膜与细胞浆蛋白

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的建立 本实验采用四动脉结扎全脑缺血模型[7]，水合氯醛麻醉大鼠后，先分离双侧颈总动脉，留线备用，并电凝其双侧椎动脉。24h后，夹闭双侧颈总动脉缺血8min，距第一次缺血48h行二次缺血3min。实验动物随机分为:①假手术组(Sham)②缺血再灌注组(I/R):大鼠缺血8min，不做第二次缺血③缺血后处理组(Postc，Postc+Veh):动物二次缺血3min④抑制剂组(Postc+NVP－A):动物在二次缺血前30min腹腔注射NR2A受体特异性抑制剂NVPAAM077(2mg/ml)⑤Sh+NVP－A组:Sham组动物不做任何处理，仅在二次缺血前30min时间点腹腔注射NR2A受体特异性抑制剂NVPAAM077(2mg/ml)⑥溶剂对照组(Veh):Postc组动物在二次缺血前30min腹腔注射同等体积1%的DMSO。每组4只。

1.2.2 蛋白样品的制备及Western blotting分别于再灌注3h、6h、12h、24h处死大鼠，低温下分离脑组织，取出海马，去除CA3区，将组织置于液氮中备用。按细胞膜与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明，将组织加入细胞膜蛋白提取液匀浆，经过4℃，700g离心10min，收集上清，再次4℃，14000g离心30min，收集上清即为浆蛋白，沉淀加裂解液继续离心取上清，即为细胞膜蛋白。根据BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度，将75ug的蛋白按参考文献[8]电泳和电转，蛋白采用5%浓缩胶、7.5%分离胶进行电泳，然后电转到 PVDF膜上，加一抗过夜(Cadherin和NR2A抗体均为1︰500稀释)，第二天相应二抗(1:1000稀释)孵育2h，NBT/BCIP显色。

1.2.3 焦油紫染色 大鼠于再灌注5d时用10%的水合氯醛(600mg/kg)腹腔麻醉，剪开动物暴露其心脏，将穿刺针从心尖部经左心室穿至升主动脉，用止血钳固定，剪去右心耳，依次用生理盐水、4%多聚甲醛灌注，灌注完毕后断头取脑，置于4%多聚甲醛中，24h后置于30%蔗糖中脱水至完全沉淀，用OCT包埋。组织于用冰冻切片机冠状切片约15μm，焦油紫染色1h，经酒精梯度脱水、二甲苯透明后用树胶封片。

1.3 图像分析 蛋白条带采用Image J软件进行分析，焦油紫染色的切片在光镜下计算生存细胞数。

1.4 统计学处理 采用Sigmastat软件分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，统计分析采用方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法 (LSD)，实验组间比较采用q检验(Newman－keuls test)，P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 脑缺血再灌注5d各组海马CA1区生存神经元数 与I/R组相比，Postc组(Postc+Veh)生存的神经元数目明显增加(P＜0.05)，抑制剂组(Postc+NVP－A)与I/R组相比，生存的神经元数显著减少(P ＜0.05)，见图1。

图1 焦油紫染色显示各组海马CA1区生存的神经元数

*P ＜0.05 vs.I/R 组;#P ＜0.05 vs.I/R 组

图2 Western blotting技术检测NR2A在各时间点的蛋白表达

与缺血再灌注相同时间点相比，* P＜0.05;－:IR;+:Postc

图3 NVPAAMO77对再灌注24h海马CA1区NR2A蛋白表达的影响

与I/R组相比，*P ＜0.05;与I/R组比较，#P ＜0.05

2.2 NR2A免疫印迹检测结果 如图2所示，与缺血再灌注组相同时间点相比，Postc组于再灌注3、6、24h和72h时间点NR2A的蛋白表达均显著升高(P＜0.05)，细胞膜标志蛋白Cadherin的蛋白表达与各个时间点均无显著变化，表明各组电泳蛋白上样量相等。

2.3 NVPAAM077对NR2A蛋白表达的影响 如图3所示，Postc后24h，Postc+Veh组NR2A蛋白表达较缺血再灌注 (I/R)相同时间点明显增加(P＜0.05)，而 NR2A抑制剂NVPAAMO77可显著抑制此变化(P＜0.05)。

3 讨论

大量的研究已经证实，缺血后处理对于脑中风具有保护作用，它可以显著地降低脑梗死面积[9]，减少缺血性神经元损伤[6]。然而，其具体机制尚不清楚。现代神经生物学研究已证实，缺血性脑中风的发生与谷氨酸的的兴奋毒性有着密切的联系。谷氨酸是中枢神经系统内最重要的的神经递质，NMDA受体是一种主要的离子型谷氨酸受体。在脑中风的主要发生区域—前脑中，主要存在的NMDA受体是NR2亚单位，其中主要是NR2A和 NR2B存在于成年小鼠的海马中[10]。Sakimura等[11]研究证实NR2A基因突变的小鼠空间学习记忆能力和海马CA1区的LTP幅值都明显减弱。NMDA受体的NR2A亚基在全脑缺血后处理中的作用尚未见报道。为了证明这一点，本实验采用了NR2A受体的特异性抑制剂NVPAAM077，焦油紫染色证实，与Sham组相比，NVPAAM077组海马CA1区存活的神经元数明显减少。因此，我们可以推断，NR2A亚基在脑缺血中具有保护作用。为了进一步证实这种保护作用，本实验采用了Western blot观察再灌技术注 3、6、24、72h NR2A 的表达，结果显示在缺血后处理组其表达量均高于再灌注组。在再灌注的24hNR2A表达量增加更明显，取这个时间点测各组NR2A蛋白的含量，可见，与IR组比，抑制剂组NR2A表达明显减少，而溶剂对照组NR2A含量明显增加，这些结果证实了缺血后处理是通过激活NR2A亚基起作用的。Liu等[12]采用体内和体外研究也发现，在局灶性脑缺血中，激活NR2A亚基可以促进神经元生存。其机制可能是在缺血的早期，由于应激产生的大量的谷氨酸具有神经毒性，可以促进神经元的死亡，随后，机体进入自我修复过程，由于NR2A通道的开放，引起钙内流入细胞内，从而诱发其突触可塑性的一系列反应，促进神经元生存。

本实验表明在缺血后处理脑保护作用中，主要是通过NR2A亚基起作用的，为临床治疗脑中风提供新靶点。

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