BARF1基因转染对人胃上皮细胞Bcl－2表达的影响

张 科 张 垅 李淑英 杜海军 赵 莹 张云茹 周 玲 曾 毅

(河北联合大学基础医学院 河北唐山 063000;①河北省辛集市第二医院;②中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室，传染病预防控制国家重点实验室病毒性肿瘤组)

胃癌(gastric carcinoma，GC)的发生、发展与多种因素相关，如化学致癌物(包括吸烟、嗜酒及亚硝胺)、营养(包括维生素和微量元素)缺乏及微生物(包括细菌、真菌及病毒)感染等。有研究显示:大约10%的胃癌与EB病毒(EPstein－Barr virus，EBV)有关[1]，BARF1是EBV编码的BamH I A区域的早期裂解基因，是近年来确认的EBV新的致癌基因，可促进上皮细胞永生化和转化等功能[2，3]。本项研究采用携带 BARF1基因的真核表达载体，转染人胃上皮细胞，探讨BARF1基因转染对人胃上皮细胞Bcl－2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 B95－8细胞、真核表达载体 PIRES2－EGFP/BARF1及GES－1细胞本室保存。RNA提取试剂盒、RT－PCR试剂盒、RPMI1640细胞培养液、DMEM培养液、小牛血清、CCK－8试剂盒及2xPower Taq PCR Master Mix均购于北京百泰克生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养。B95－8细胞使用 RPMI1640，GES－1细胞使用DMEM，并在培养液中添加10%灭活的小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。培养于37℃，5%CO2的温箱中，每2～3天换1次液。

1.2.2 细胞的转染与克隆。用 lipofectamine2000介导，将PIRES2－EGFP空载体及携带目的基因BARF1的真核表达载体转染人胃上皮细胞GES－1(按试剂盒说明书操作)。用有限稀释法进行克隆，转染后第3天将细胞消化分散，按每孔200个细胞接入48孔细胞培养板，用含有300μg/mL的G418培养液进行筛选，每2～3天换1次液，长出抗性克隆后扩大培养。

1.2.3 转染细胞鉴定BARF1基因的表达。将抗性克隆细胞扩大培养后，提取细胞RNA，RT－PCR鉴定BARF1基因的表达，所用引物如表1。PCR产物在含0.01%Gold View(核酸染料)的1.5% 琼脂糖凝胶上电泳检测。电泳后在凝胶成像仪照相。

表1 本研究中使用的扩增引物

1.2.4 免疫组化法检测Bcl－2的表达状况。取对数生长期细胞，经0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM制成单细胞悬液，做活细胞计数，使细胞浓度为1×104个细胞/mL。将细胞悬液加入6孔板中，每孔加入10片已灭菌的盖玻片，待盖玻片中细胞汇合度达70% ～80%，停止培养。用PBS洗3次;用4%多聚甲醛4℃固定;免疫组化法(按试剂盒说明书操作)检测Bcl－2的表达;Bcl－2定位于细胞浆，在染色标本片上于细胞浆中见到均匀棕黄色颗粒分布判为阳性，阴性结果不显色，经苏木精复染后，细胞核显示复染的蓝色。

2 结果

2.1 单克隆细胞的获得 G418为新霉素类似物，可以杀死没有其抗性的细胞，而我们构建的BARFl真核表达载体和空载体PIRES2－EGFP均具有neo抗性，所以通过G418可以筛选出阳性克隆细胞。约2周后即可看到有G418抗性克隆出现，而载体没有成功转染的细胞均已死亡。每种转染细胞分别挑出3个单克隆扩大培养。

2.2 转染细胞鉴定BARF1基因的表达 从阳性克隆细胞(包括BARFl转染的细胞和空载体转染的细胞)里提出总RNA，逆转录，以逆转录产物为模板PCR扩增BARF1，扩增长度为524 bp(图1)。

图1 真核质粒双酶切鉴定

2.3 Bcl－2表达结果 Bcl－2的表达定位在细胞浆，阳性表达在细胞浆可见到均匀棕黄色颗粒分布，阴性结果不显色，经苏木精复染后，显示复染的蓝色。免疫组化染色结果显示:GES－1、转染了空载体的GES－1细胞均为检测到Bcl－2的表达，而转染BARF1基因组的细胞浆中都能见到棕褐色的阳性结果(如图①、②、③)。

图1 GES－1未转染细胞bc1－2检测结果

图2 GES－1转染空载体细胞Bc1－2检测结果

图3 GES－1转染BARF1细胞Bc1－2检测结果

3 讨论

BARF1是近年来确认的EBV新的致癌基因，其致癌作用日益受到关注。李友琼等[4]将 BARF1基因转染胃癌细胞系SGC7910后，能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性。

本研究通过脂质体介导，将携带BARF1基因的真核表达载体PIRES2－EGFP/BARF1转染人胃上皮细胞GES－1，建立了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞GES－1/BARF1，为进一步探讨BARF1基因在胃癌发生及发展中的作用奠定了基础。

Bcl－2是目前已知抑制细胞凋亡最重要的一种基因，其编码蛋白是抑制细胞程序化死亡的关键因子，Bcl－2的高表达能使细胞凋亡减少，存活细胞数量增多而诱使肿瘤发生。Ohfuji[5]等研究了bcl－2在伴有淋巴基质的EBVaGC与不伴有淋巴基质胃癌的表达，结果表明，在EBVaGC中bcl－2表达增加，凋亡信号减少;Kume等[6]对EBVaGC及EBVnGC进行细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达进行对比研究，结果发现EBVaGC组表现为低凋亡和 bcl－2 高表达[7，8]，EBVaGC 中高 bcl－2 表达可能对肿瘤细胞的凋亡有保护作用。Sheng等[9]利用缺失突变的方法证实，EBV编码的BARF1基因N－末端蛋白是细胞发生恶性转化所必须的区域，并且BARF1基因具有活化抗凋亡基因bcl－2表达的能力。本项研究结果显示:未转染的GES－1细胞中不表达或低表达Bcl－2蛋白，而BARF1转染的GES－1细胞中Bcl－2高表达。这些结果表明，BARF1与Bcl－2的相互协调对于恶性转化的发生是至关重要的，该基因可促进上皮细胞永生化和转化，在EB病毒相关胃癌的发生、维持恶性细胞的肿瘤原性及抗调亡中均起重要作用。

[1] Burke A P，Yen T S，Shekitka K M，et al.Lymphoepithelial carcinoma of the stomach with Epstein－Barr virus demonstrated by polymerase chain reaction[J].Mod Pathol，1990，3(3):377

[2] Seto E，Yang L，Middeldorp J，et al.Epstein Barr virus(EBV)encoded BARF1 gene is expressed in nasopharyngeal carcinoma and EBV-associated gastric carcinoma tissues in the absence of lytic gene expression[J].J Med Virol，2005，76(1):82

[3] Fiorini S，Ooka T.Secretion of Epstein Barr virus encoded BARF1 oncoprotein from latently infected B cells[J].Virol J，2008，5(70):1186

[4] 李友琼，张雪怡，曾 健，等.EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响[J].江苏大学学报(医学版)，2009，19(3):214

[5] Ohfuji S，Osaki M，Tsujitani S，et al.Low frequency of apoptosis in Epstein－barr virus－associated gastric carcinoma with lymphoid stroma[J].Cancer，1996，68(6):710

[6] Kume T，oshima K，Shinohara T，et al.Low rate of apoptosis and overexerpression of bcl－2 in Epstein－barr virus－associated gastric carcinoma[J].Hisopathology，1999，34(6):502

[7] Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of apoptosis by bcl－2:release of cytochromec from mitochondira blocked[J].Science，1997，275(5303):1129

[8] Vaux DL，Cory S，Adams J，et al.Bcl－2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c－myc to immortalize pre－B cells[J].Nature，1988，335(6189):440

[9] Sheng W，Decaussin G，Sumner S，et al.N － terminal domain of BARF1 gene encoded by Epstein－Barr virus is essential for malignant transformation of rodent fibroblasts and activation of BCL －2[J].Oncogene，2001，20(10):1176