基于MTT法的波棱瓜子抗肝纤维化用量初步研究

徐和 戴领 沈成英 韩晋 袁海龙

长期以来，中药临床功用与质量评控模式不相适宜，临床应用上中药的品质含量与临床用量(质—量)也是分离的，无论药材中药效成分量的高低，临床用量却未作出调整，导致临床疗效不确切或不稳定。然而事实上，中药质—量是密不可分、相互依存的。中药的用量不同于化学药，化学药用量与其含量是直接相关的。中医临床潜方用药，面对品质含量相差甚远的中药，而临床用量设置却未有区别［1-3］。

波棱瓜子是葫芦科波棱瓜属波棱瓜(Herpetospermum caudigerum Wall.)的干燥成熟种子［4］，为藏医常用药，用于治疗赤巴病、肝病、胆病以及消化不良［5］。波棱瓜子具有保肝降酶、抗肝炎病毒等功效［6］，在各大藏医院广泛应用，在用于治疗肝病的藏药成方制剂中，有一半以上以波棱瓜子入药。波棱瓜子药材中主要药效成分为木脂素类成分［7］。前期通过对波棱瓜子的研究发现，波棱甲素(herpetrion，PEDX)为波棱瓜子保肝降酶的关键药效组分［8］。然而临床上，波棱瓜子用于肝病治疗时用量多凭经验总结，为了制定其科学合理的用量范围，本文以PEDX的量效关系为核心进行研究［9］，通过含量比例进行转换，制定波棱瓜子质量控制标准含量上下限，将此模式示范应用于中药抗肝纤维化质量控制方法研究，为实现“中药质量标准更加贴近临床，临床用量更加科学有据”提供新思路和方法，深化中医药的量效关系理论［10］。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器

波棱瓜子提取物(自制，PEDX含量为20.8%);PEDX对照品(自制，纯度超过98%)。人肝星状细胞系LX-2细胞，购自北京协和细胞库;DMEM培养液(美国Gbico公司，批号:1255136);胎牛血清(美国HyClone公司，批号:DPEO166);四甲基偶氮唑盐(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，批号:1324B37)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，批号:20120305224)均购自美国Amresco公司;乙腈(色谱纯，加拿大Promptar公司)，其他试剂均为分析纯。

LC-20AT高效液相色谱仪 SPD-M20A检测器(日本Shimadzu公司);BSA124S型精密电子天平(德国Sartorius公司);XDS-1B型倒置生物显微镜(北京京瑞天下科技有限公司);Forma Series II水套CO2培养箱(3110 Series II水套，Thermo Fisher公司);全波长酶标仪(Multiskan GO型，Thermo Scientific公司)。

1.2 PEDX系列样品HPLC指纹图谱的建立

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Alltima C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈 －2%冰醋酸水溶液(24∶76)，流速:1.0 ml·min－1，检测波长:280 nm，柱温:25℃，进样量:10 μl。

1.2.2 PEDX阴性样品的制备 称取波棱瓜子提取物35 g用8倍量溶剂溶解，上中压硅胶柱制备，其中溶剂由质量比为3∶2的石油醚和丙酮组成，中压硅胶柱由三支粒度为200～300目的120 g硅胶柱串联组成，流动相由石油醚∶乙酸乙酯∶丙酮按2∶7∶1的质量比组成，检测波长为240 nm，流速为120 ml·min－1，收集不含 PEDX 的馏分，回收干燥，即得 PEDX 阴性样品［11］。

1.2.3 PEDX对照品溶液的制备 精密称取PEDX对照品8.0 mg，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为160μg·ml－1的PEDX对照品储备液。

1.2.4 PEDX系列样品溶液的制备 按表1将不同剂量的PEDX对照品加入到不含该成分的阴性样品溶液(以下称阴性样品溶液)中，制备不同浓度梯度的PEDX系列样品。溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进高效液相色谱仪。

表1 PEDX样品的加入量

1.3 PEDX系列样品对LX-2增殖的影响

各系列样品先用DMSO溶解，再用培养基稀释到各个不同的浓度，并使 DMSO的浓度低于1.0%［12］，不含药物的空白溶剂作阴性对照。取对数生长期的 LX-2细胞，用 0.25%胰蛋白酶 －0.02%EDTA消化，按1×104/ml的浓度接种于96孔培养板中，每孔体积200μl，细胞培养24小时后，弃去上清，温育48小时。弃去上清，按1.2.4项下制备方法加入PEDX系列样品溶液，每组设6个平行孔，作用6小时，吸去上清液，每孔加入5 mg·ml－1的MTT液20μl，继续孵育4小时，终止培养，弃去上清液，加入DMSO 200μl，振荡10分钟后，在492 nm波长下，用全波长酶标仪测定各孔吸光值(OD492)。根据下面的公式计算各系列样品的抑制率。

OD1:系列样品吸光值;OD0:空白溶剂吸光值

1.4 观察项目

按1.2.1项下色谱条件记录系列样品在60分钟内的色谱图，并进行指纹图谱分析。在进行MTT实验之前，倒置显微镜观察培养细胞的形态，选取生长、形态良好的细胞用于MTT实验。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析处理，细胞抑制率数据以均数±标准差(x±s)表示。两组间的均数检验采用方差分析，P＜0.05或P＜0.01时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEDX系列样品HPLC指纹图谱

按照1.2.1项下色谱条件记录60分钟内的色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行分析，指纹图谱如图1所示。相似度计算得到S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8 之间的相似度均为1.0，结果表明样品Ⅰ～Ⅵ相似度良好，最终得到了不同浓度梯度的PEDX系列样品。阴性样品在PEDX保留时间处无吸收，在其余特征峰保留时间处均有吸收，说明PEDX与阴性样品各特征峰间无相互干扰，最终得到不含PEDX的阴性样品。

图1 PEDX系列样品指纹图谱

2.2 LX-2细胞抑制率的测定

PEDX系列样品作用于LX-2细胞6小时后的OD492值如表2，根据抑制率计算公式得到各样品抑制率。建立各系列样品的量M与细胞抑制率I值的“量—效”关系曲线，如图2。由PEDX组分的“量—效”关系可知，当“量”增加到一定程度时，相应的“效”增加的幅度减缓，甚至减弱。进一步说明波棱瓜子中PEDX的“量”对其“效”起着至关重要的作用，并不是“量”越大越好，也不是越小就不好。据图2中的“量—效”关系曲线图，确定波棱瓜子中药效组分PEDX的最小有效用量为0.68 mg，这一阈值可作为中药质量标准含量控制的下限，最大有效用量为8.2 mg，此用量即是方药安全有效“治疗窗”的最大用量，可作为方药质量标准含量控制的上限。通过含量关系转换，可知波棱瓜子的最小有效用量为3.27 mg，最大有效用量为39.42 mg。

表2 PEDX系列样品对LX-2细胞增殖的影响

图2 PEDX系列样品的“量—效”关系曲线

3 讨论

本研究在前期目标成分研究的基础上，确定了PEDX为抗肝纤维化的药效关键组分。通过不同剂量PEDX组分的加入，采用体外LX-2细胞增殖实验进行药效学评价，阐明“量—效”关系，进而通过“量—效”关系曲线的变化，找到加入的PEDX的最低含量点、最高含量点，再转换为人用剂量，以此可以制定药物的“治疗窗”或推荐临床用量范围，为波棱瓜子抗肝纤维化作用“含量”标准的制定提供了方法［13］。以此阐明中药的组分含量与临床用量的相关性，建立面向临床、关乎药效的质量控制方法。

该研究模式的关键技术在于如何制备阴性样品，为保障目标成分及其阴性样品的完整性，分离手段和方法是关键。要有高提取率、高回收率、无损、无残留的成分快速分离技术，即一方面要多快好省地获得目标成分，同时对剩余阴性样品要尽可能地保持无损和完整，目前薄层色谱技术和制备型、中压柱层析系统是较好的解决手段。

该研究结果的获得及“量”的标准的制定，为实现中药药效物质质量控制“找得准、测得准、定得准”目标提供了方法和思路，也为解决目前中药质控格局“量而不准”的症结提供参考，有望成为中药药效物质质量控制的新模式。

进行面向临床的中药质—量一体化研究，建立质量与用量之间换算机制，使临床用量科学、合理、有据。以点代面，以药带方，逐步将此模式推广应用到其他方药，从而实现中药质量控制从质—量分离向质—量一体转变，为中医药临床合理用药特别是为实现中药用量标准从无据可依到有据可依提供有力的科技支撑。

［1］鄢丹，熊吟，马丽娜，等.建立以临床功用为导向的中药质量评控格局与适宜模式的设想［J］.中草药，2013，44(1):1-5.

［2］黄璐琦，唐仕欢，杨洪军.论中药用量的特点及研究的关键点［J］.中医杂志，2009，50(3):203-205.

［3］肖小河，金城，鄢丹，等.中药大质量观及实践［J］.中草药，2010，41(4):505-508.

［4］丛龙波，王琪，李仙义，等.藏药波棱瓜子抗肝炎药效物质基础研究［J］.医学研究杂志，2007，36(8):75-76.

［5］Li LY，Deji LM，Wei YF，et al.Literature data investigationin semem of Herpetospermum pedunculosum ［J］.China J Chin Mat Med，2005 Jun，30(12):893-895.

［6］韩玉梅，李正明，袁海龙，等.肝能滴丸在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(4):43-44.

［7］YUAN Hai-long，LIU Yi，ZHAO Yan-ling，et al.Herpetin，a new bioactive lignan isolated from Herpetospermum caudigerum［J］.J Chin Pharm Sci，2005，14(3):140-143.

［8］YUAN H L，YANG M，LI X Y，et al.Hepatitis B virus inhibiting constituents from Herpetospermum caudigerum ［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2006，54(11):1592-1594.

［9］肖小河，鄢丹，袁海龙，等.基于成分敲除/敲入的中药药效组分辨识与质量控制模式的商建［J］.中草药，2009，40(9):1345-1348，1488.

［10］YUAN Hai-long，ZHANG Tian-tian，XIAO Xiao-he.Knock-out＆knock-in:A novel approach for Herbal medicine research［C］.BIT's 8th Annual Congress of IDDST，2010，Beijing，China.

［11］袁海龙，郭静静，李仙义，等.一种制备Herperione的方法及其应用、其胶囊剂及胶囊剂的制备方法和应用:中国，201110072191.9 ［P］.2011-08-03.http://211.157.104.87:8080 / sipo /zljs/hyjs-yx-new. jsp? recid =CN201110072191.9＆leixin=fmzl＆title= 一种制备 Herperione的方法及其应用、其胶囊剂及胶囊剂的制备方法和应用＆ipc=C07D493/04(2006.01)I.

［12］赵庆兵，黄文，吴文芳，等.盾叶薯蓣难溶性甾体皂苷的提取及其抑制人肝癌细胞HepG2增殖的研究［J］.华西药学杂志，2010，25(5):527-529.

［13］孔维军.基于成分敲出/敲入的中药(牛黄)药效物质辨识和质量控制模式的初步研究［D］.成都:成都中医药大学，2011.