破布木果总多酚的超声提取工艺研究

2013-08-24刘枫张雪佳李洁田树革

环球中医药 2013年8期

刘枫张雪佳李洁田树革

维药破布木果为紫草科(Boraginaceae)植物破布木Cordia dichotoma Forst.f的干燥成熟果实，秋季果实采摘，晒干［1］。维吾尔医认为破布木果功效生湿生热，成熟异常黑胆质，润肺润喉，止咳化痰，清音止渴，通便利尿。主治干寒性或黑胆质性疾病，如咽干喉燥，乃孜来性感冒，干咳顽痰，失音口渴，小便不利，大便不畅等［2］。破布木喜生于低海拔林中，云南、广西、广东、台湾、福建有分布，印度、越南、澳大利亚东北部、菲律宾等亦有分布［2］。

植物多酚是一种广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，又称单宁，是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物，在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，广泛存在于植物的皮、根、叶、果中，含量可达20%［3］。植物多酚的多元酚结构使其具有抗肿瘤、抗氧化、抗脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等多种理功能［4-7］，从而广泛应用于食品、医药、化妆品、日用化学品以及保健品等领域［8-11］。

超声波辅助提取是一种利用外力强化提取的新技术，具有提取时间短、提取效率高、能耗低等优点，被广泛用于天然香料、植物酶、中草药活性成分等的提取［12］。超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断振荡，有助于溶质扩散，可以明显地加速植物体和种子中有机成分的提取过程［13］。本文以破布木果作为原料，以没食子酸为对照品，采用超声辅助Folin-Ciocalteu比色法［14］测定破布木果中多酚含量，优化了最佳提取条件，进行了方法学考察，建立了破布木果总多酚含量的分析方法，为破布木果的开发利用提供研究基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KQ-500DE型数控超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司);紫外可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司GBCCintra-40型);AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);TGL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂);B-260型水浴锅(上海亚荣生化仪器厂);AK-1000A型500克摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)。

1.2 材料

没食子酸对照品(天津市光复精细化工研究所，含量:99%);破布木果来自新疆麦迪森维药有限责任公司饮片厂。经高速万能粉碎机粉碎后成细粉，过40目筛，即得。无水碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、乙醇等。所用试剂均为分析纯，实验用水为自制蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 总多酚含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品10 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解，并定容至刻度，即得0.1 mg/ml的没食子酸对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取干燥后的破布木果粉末1 g，置于锥形瓶中，加50%(体积分数)乙醇50 ml，超声提取30分钟。离心，取上清液定容至50 ml的容量瓶中，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 Folin—Cioealteu试剂(磷钼钨酸试液)的制备称取钨酸钠100.0 g和钼酸钠25.0 g，置于圆底烧瓶中用700 ml蒸馏水溶解，加入85%的磷酸50 ml和100 ml浓盐酸充分混匀，小火加热回流12小时，放冷，再加入150 g硫酸锂，50 ml蒸馏水及0.2 ml双氧水，加热沸腾15分钟至亮黄色，不得带微蓝和绿色，使双氧水完全挥发，冷却后用蒸馏水定容至1000 ml，过滤，于棕色瓶中避光储存。

2.1.4 最大吸收波长的扫描取对照品溶液和供试品溶液各1 ml，置于25 ml比色管中，加入磷钼钨酸试液1 ml，再加20%(质量分数)的碳酸钠溶液2 ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，在40℃水浴恒温30分钟。以相应的试剂为空白，在波长 550～800 nm范围内进行扫描，结果表明二者最大波长均为746 nm，故确定检测波长为746 nm，见图1。

图1 对照品溶液和供试品溶液的吸收谱图

2.1.5 测定方法准确量取1 ml供试品溶液置25 ml干燥具塞比色管中，加入磷钼钨酸试液1 ml，再加20%(质量分数)的碳酸钠溶液2 ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，在40℃水浴恒温30分钟。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，制作不加显色剂的对照管。于746 nm波长处测定各吸光度值。

2.1.6 标准曲线的绘制与线性关系精密吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml于10 ml干燥具塞比色管中，加入Folin—Cioealteu试剂1 ml，再加20%(质量分数)的碳酸钠溶液2 ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，在40℃水浴恒温30分钟，于746 nm波长处测定各吸光度值。以吸光度值A对对照品质量浓度C作图，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程为 A=145.2857C+0.03271，r=0.9995。没食子酸在0.001～0.007 mg/ml范围内与其吸光度值呈现良好的线性关系，标准曲线见图2。

图2 没食子酸标准曲线

2.1.7 精密度试验精密吸取质量浓度为0.003 mg/ml的对照品溶液，按2.1.5方法显色后连续测定6次吸光度。计算RSD值为0.41%，结果表明该方法测定破布木果多酚精密度良好。

2.1.8 稳定性试验取供试品溶液，分别于配制后的0、30、60、120、180、240 分钟，按 2.1.5 方法显色后连续测定6次吸光度。结果表明，供试品溶液在30分钟内较为稳定，然后稳定下降，因此，供试品溶液在配制完成后应在30分钟内测定吸光度。

2.1.9 重现性试验取同一批号的药材粉末6份，按2.1.2所述方法制备，按2.1.5方法显色后连续测定6次吸光度。计算RSD值为0.19%，结果表明该方法测定破布木果多酚重现性很好。

2.1.10 加样回收率试验精密称取已知质量分数(3.23 mg/g)的样品各0.5 g，共6份，精密加入没食子酸对照品3.2 mg，按“2.1.2”所述方法制备，按“2.1.5”所述方法显色后测定吸光度，计算RSD值为101.46%，结果表明该方法加样回收率试验很好。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对提取率的影响取破布木果粉末5份，每份1 g，以乙醇体积分数分别为10%，30%，50%，70%，90%，固定料液比为 1∶20，超声时间30分钟，超声波功率400 W进行超声提取。以提取液中多酚含量为指标，研究乙醇体积分数对提取率的影响。乙醇体积分数对提取率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对破布木果总多酚提取率的影响

结果表明，其他条件不变时，随着乙醇体积分数的增大，多酚含量先升高后降低，并且当乙醇体积分数为50%时，多酚质量浓度最高为4.10 mg/g。所以选择乙醇体积分数为50%。

2.2.2 料液比对提取率的影响取破布木果粉末5份，每份1 g，改变料液比，以体积分数50%的乙醇为溶剂，超声时间30分钟，超声波功率400 W进行提取。以破布木果提取液中多酚含量为指标，考察固料液比对提取率的影响。料液比对提取率的影响见图4。

图4 料液比对破布木果总多酚提取率的影响

结果表明，其他条件不变时，当料液比为1∶30时，多酚的得率最高，随着溶剂量的增大，多酚含量呈上升趋势;但当料液比在1∶30～1∶35时，提取液中多酚含量变化不大，所以选择料液比为1∶30。

2.2.3 时间对提取率的影响取破布木果粉末5份，每份1 g，以体积分数50%的乙醇为提取溶剂，料液比为1∶30，超声波功率400 W，超声时间分别10、20、30、40、50 分钟进行提取。以提取液中多酚含量为指标，考察提取时间对提取率的影响。提取时间对提取率的影响见图5。

图5 时间对破布木果总多酚提取率的影响

结果表明，其他条件不变时，随着提取时间的延长，提取液中多酚含量先升高后降低。当提取时间为30分钟时，多酚含量最高为2.81 mg，30分钟后提取液中多酚含量反而降低，所以选择提取时间为30分钟。

2.2.4 功率对提取率的影响取破布木果粉末4份，每份1 g，以体积分数50%的乙醇为提取溶剂，料液比为1∶30，超声时间30分钟，超声波功率分别为200、300、400、500 W，超声波作用时间为30 分钟时进行提取。以提取液中多酚含量为指标，考察超声功率对提取率的影响。超声功率对提取率的影响见图6。结果表明，其他条件不变时，随着超声功率增大，破布木果多酚提取率增大。所以选择超声功率为500 W。

图6 功率对破布木果总多酚提取率的影响

2.3 正交试验优选破布木果总多酚超声辅助提取工艺

在单因素实验的基础上，为了筛选更适宜的提取条件，选取乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时间(C)和超声功率(D)4个因素，每个因素3个水平，按照L9(34)正交表的试验设计，以优化超声波提取破布木果中总多酚的最佳提取工艺参数。正交试验因素与水平设计见表1，正交试验结果与方差分析结果见表2及表3。