景德镇市两例重症E V71手足口病毒VP1区基因型分析

胡芹，涂智杰，吴集才，魏建萍，张敏，曹健

(景德镇市疾病预防控制中心，江西 景德镇 333000)

手足口病是一种常见及轻微但传染度颇高的传染病，可由多种肠道病毒引起。此病多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔、臀部等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，进而危及生命[1]。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中以柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。本实验室自2009年开展此病的病原学监测以来，每年都有临床重症病例，甚至包括死亡病例送检。为了解景德镇地区重症病例临床症状差异性形成的生物学基础，本实验室采集2例手足口临床症状有差异性的重症标本进行生物信息学分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2011年景德镇市珠山区疾控中心采集的 2例重症手足口咽拭子标本(2011JDZ35,2011JDZ202)，其中1例出现明显神经症状，1例未出现神经症状，-80oC保存。

1.2 病毒分离与鉴定 RD细胞由江西省疾病预防控制中心疾病检验所提供；EV71病毒分离与鉴定按《手足口病预防控制指南》(2009版)操作规程进行：标本接种RD细胞，置于36℃培养，每天观察细胞病变(CPE)，当 CPE 达＋＋＋～＋＋＋＋时收获，并通过RT-PCR进行鉴定[2]。

1.3 病毒RNA的提取及基因测序 采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit，按照试剂盒说明书操作。取病毒培养液上清液200μl提取RNA,最终收集RNA提取液30μl。使用Promega公司的M-MLV试剂盒制备病毒的cDNA。根据本实验室已有引物[3]，使用TaKaRa LA Taq试剂盒完成相应片段的PCR扩增。产物经胶回收后送上海捷瑞公司进行测序。使用DNAstar软件包中的SeqMan对序列片段进行拼接、编辑、校正。将2011JDZ35与2011JDZ202株与GenBank登录的国内外不同地域并具有不同基因型的12个EV71病毒株作为参考株，并选择Cox.A16(G10)为外群，用Mega5.1 Beta2软件采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)进行序列分析，Bootstrap值设定为1000，获得VP1区系统进化树并对其进行系统进化分析。

2 结果

2.1 序列分析 2例手足口重症病例都由EV71病毒引起，2株EV71病毒株(2011JDZ35,2011JDZ202)全基因组核苷酸序列已被GenBank数据库收录，GenBank登录编号分别为JQ806378和KC109780。2.2病毒基因亲缘进化分析 系统进化树显示本地实验株与近几年来流行于内地的毒株亲缘关系较近，同属于C4a亚型，并且景德镇2011JDZ35与安徽阜阳株EU703812为同一遗传分支、2011JDZ202与浙江宁波株2011NB65为另一遗传分支[4，5]。 见图 1。

图1 EV71 VP1编码区核苷酸遗传进化分析

2.3 VP1氨基酸序列比对 2011JDZ35有两个位点发生明显变异，第19位丙氨酸由缬氨酸取代(A→V)，第 106位酪氨酸由苯丙氨酸取代 (Y→F)。2011JDZ202有三个位点发生明显变异，第19位丙氨酸由半胱氨酸取代(A→C)，第38位精氨酸由谷氨酰胺取代(R→Q)，第293位丙氨酸由丝氨酸取代(A→S)。具体结果见图2、图3。

图2 2011JDZ202 VP1区protein blast结果

图3 2011JDZ35 VP1区protein blast结果

3 讨论

手足口病是冬春季节儿童的多发病，由于疾病初起时症状不明显易被家长忽视，而一旦病情耽误极易恶化，逐渐发展成重症病例。伴随神经系统并发症的出现还可能造成病儿的死亡。本实验室所检测的重症病例都由EV71病毒引起，由此可见EV71病毒在手足口病的防控工作中不容忽视。

EV71病毒的VP1基因全长891bp，其编码蛋白位于病毒外膜蛋白的最外面，因此VP1蛋白是EV71主要的病毒中和决定因子，具有与病毒血清型相对应的遗传多样性，是基因分型和遗传进化分析的重要研究对象[6]。而且VP1蛋白对病毒侵入何种受体细胞起到绝对性的作用。根据VP1基因的差异可以将EV71分为A,B和C三个基因型，并且还可以再细分为B1-B5、C1-C5亚型。本实验室分离到的EV71病毒株2011JDZ35和2011JDZ202均属于C4a亚型，与国内近几年来主要流行株亚型一致。

从对VP1氨基酸序列比对发现，2011JDZ202株在297个氨基酸位点的比对中发现有3个位点发生了明显变异，分别是在第19位，38位，和293位；而2011JDZ35株有2个位点发生明显变异，分别是在第19位和106位。以上位点的突变具有一定的规律性，相对保守。VP1区位于病毒衣壳的最外面，其内部的氨基酸改变能够引起外膜蛋白的结构变化，使其可能能够突破血脑屏障，出现脑炎症状。猜测上述突变位点对病毒的临床表现提供了相应的生物学基础。

[1]金奇.医学分子病毒学[M].北京:科学出版社,2001:606-613.

[2]黄建国,吴立文,骆志辉,等.手足口病肠道病毒 EV71和CoxA16感染的检测分析[J].实验与检验医学,2011,29(3):328-329.

[3]涂智杰,胡芹,曹金萍.肠道病毒71型景德镇分离株全基因组序列分析[J].军事医学,2013;37(1):69-72.

[4]Zhang Y,Zhu Z,Yang W.An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of hand foot and mouth disease in Fuyang city of China[J].Virol J,2010,7:94.

[5]王璟,许国章,顾文珍.肠道病毒71型宁波分离株全基因组特征研究[J].中国卫生检验杂志 2012;22(2):270-272.

[6]檀晓娟,许文波.肠道病毒71型的分子流行病学现况[J].中国疫苗和免疫,2008,14(4):361-367.