国标法测定总氮中有关时间因素影响分析

● 太原市质量技术监督检验测试所 周炜环

实验部分

1.仪器与试剂

仪器：双光束紫外分光光度计，LDZX-30KBS手轮式自动型不锈钢立式压力蒸汽灭菌器，25mL具塞磨口玻璃比色管，10mm石英比色皿。试剂：硝酸钾（GR），过硫酸钾（GR），氢氧化钠（AR）。

2.实验原理

在120℃～124℃下，碱性过硫酸钾溶液使样品中含氮化合物的氮转化为硝酸盐，采用紫外分光光度法于波长220nm和275nm处，分别测定吸光度A220和A275，按公式(1)计算校正吸光度，总氮(以N计)含量与校正吸光度A成正比。

3.分析步骤

（1）标准曲线的绘制

分别量取0.00mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、3.00mL和7.00mL硝酸钾标准使用液于25mL具塞磨口比色管中，其对应的总氮(以N计)含量分别为0.00μg、2.00μg、5.00μg、10.0μg、30.0μg和70.0μg。加水稀释至10.00mL，再加入5.00mL碱性过硫酸钾溶液，用纱布扎紧管塞以防弹出。将比色管置于压力灭菌器内，加热至顶压阀吹气，关阀，继续加热至120℃，保持120℃～124℃，消解30min。自然冷却，取出比色管冷却至室温并摇匀。每个比色管分别加入1.0mL盐酸溶液，用水稀释至25mL，盖塞摇匀，用10mm石英比色皿上紫外分光光度计，以水作参比，于波长220nm和275nm处测定吸光度值。

式中：

Ab为零浓度（空白）溶液的校正吸光度；

As为标准溶液的校正吸光度；

Ar为标准溶液校正吸光度与零浓度（空白）溶液校正吸光度的差值。

（2）样品测定

量取10.00mL试样(适量样品用氢氧化钠或硫酸溶液调节pH值至5～9)于25mL具塞磨口玻璃比色管中，按照“（1）”步骤进行测定。

（3）空白试验

用10.00mL水（无氨水）代替试样，按照“样品测定”步骤进行测定。

结果与分析

HJ636-2012中，要求校准曲线的相关系数大于0.999；每批样品至少做一个空白试验，且其校正吸光度Ab＜0.030；每批样品至少测定10%的平行双样，样品数量少于10时，至少测定一个平行双样。当样品总氮含量≤1.00mg/L时，测定结果相对偏差应≤10%；当样品总氮含量＞1.00mg/L时，测定结果相对偏差应≤5%。

从以上要求可知，除了空白试验吸光度和校准曲线相关系数决定测定是否达标外，测定结果相对偏差是否符合也很重要。由于总氮测定是将各种形态的氮都转化为硝酸盐氮来测定，因此整个测定过程中可能掺入的氮污染，都会影响测定结果，甚至总氮测定要在无氨的实验室环境中进行。

1.过硫酸钾溶液的存放时间对测定结果的影响

HJ636-2012中碱性过硫酸钾溶液的配制：40.0g过硫酸钾溶于600mL水中，另取15.0g氢氧化钠溶于300 mL水中。待氢氧化钠溶液温度冷却至室温后，混合两种溶液定容至1000mL，存放于聚乙烯瓶中，可保存一周。研究显示，新配好的碱性过硫酸钾溶液存放3天以内，对总氮测定结果几乎无影响；超过3天，测定结果会出现较小的负偏差；超过7天，将出现严重的负偏差。表1数据显示，新配好的碱性过硫酸钾溶液存放3天以内的空白吸光度符合HJ636-2012中空白吸光度要求，但是当存放时间在3天时测定样的相对误差为7.2%，已经超过HJ636-2012中当样品总氮含量＞1.00mg/L时，测定结果相对偏差应≤5%的质控要求。相关专家认为，碱性过硫酸钾溶液15℃左右存放超过6天即不可使用，最好现用现配。表1数据表明，存放第3天开始，数据相对误差开始超出质控要求，当存放时间4天及以上时，空白吸光度超标。鉴于以上分析，为了保证测定数据能够达标、有效，配好的碱性过硫酸钾溶液最好在4℃环境中保存，且存放时间不应超过2天，如果条件允许，最好现用现配。

表1 碱性过硫酸钾溶液不同存放时间空白吸光度及10.00μg标样测定结果

2.消解时间对测定结果的影响

HJ636-2012中，要求在压力灭菌器达到120℃～124℃时消解30min。研究显示，若消解时间不足，不但会使样品内的含氮物质难以被完全氧化，而且会造成过硫酸钾不能完全分解，这将导致空白溶液A220严重偏高。表2数据显示，标准法规定的30min消解时间，不但其空白吸光度0.035大于质控要求，而且4号标样相对偏差大于5%，超出标准规定质控要求，数据无效。当消解时间延长至40min，空白吸光度0.027符合质控要求，但是4号标样的相对偏差7.2%还是不符合质控要求。相关专家建议消解时间至少控制在40min以上，以消除对空白吸光度和测定结果的影响。表2数据表明，当消解时间延长至50min甚至60min后，所测定的数据从空白吸光度和测定结果相对偏差两方面都符合标准法(HJ636-2012)质控要求，数据达标、有效。过硫酸钾本身在波长为 220nm处有强烈的吸收，如果过硫酸钾分解不完全，无论对空白吸光度还是对样品的分析结果影响都很大。鉴于以上原因及数据分析，在消解时间的控制上，建议至少延长至50min（有条件的情况下，消解时间控制在60min左右更好），空白吸光度和测定结果相对偏差才能符合HJ 636-2012的质控要求，数据达标、有效。

表2 不同消解时间空白吸光度及10.00μg标样测定结果

3.消解后冷却时间对测定结果的影响

HJ636-2012中规定，灭菌器在120℃～124℃条件下消解30min后，自然冷却，开阀放气，移去外盖，取出比色管冷却至室温。以上内容并未明确规定移去外盖后，比色管的冷却时间。但实践中发现，除了要冷却至室温外，冷却时间的取舍对空白吸光度以及测定结果也有不同程度的影响。通常在室温中冷却0.5h，比色管温度完全可以降至室温。但表3数据显示，冷却0.5h甚至1h，空白吸光度均大于0.030，不符合HJ636-2012质控要求，数据超标、无效。当冷却时间延长至1.5h，空白吸光度达到0.029，符合HJ636-2012空白吸光度质控要求，但是4号标样测定结果相对偏差达到9.2%，大于5%的质控要求，数据无效。当冷却时间延长到2h及以上时，无论是空白吸光度还是测定结果相对偏差都完全符合HJ636-2012中的质控要求。综上分析，为了保证数据准确度符合标准的质控要求，建议样品从压力锅内取出后的冷却时间延长到2h或以上。

表3 不同冷却时间空白吸光度及10.00μg标样测定结果

4.消解后冷却方式对测定结果的影响

HJ636-2012中未对采取何种冷却方式冷却至室温有明确规定，表4是灭菌器从压力锅中取出后，用冷水强制制冷0.5h的测定结果。该数据显示，在冷却过程中采取强制冷却后，数据出现异常超标。建议在冷却时不要采取任何强制制冷方式，只在空气中自然冷却至室温。

表4 冷水强制制冷0.5h测定结果

图1 正常情况下吸光度曲线

小结

为保证采用标准法（HJ636-2012）进行总氮测定数据能够符合质控要求，达标、有效，建议碱性过硫酸钾溶液最好现用现配，如果需要保存使用，最好在4℃条件下保存而且保存时间不要超过2天；在120℃～124℃条件下的消解时间延长到50min及以上；移出压力灭菌器后冷却时间至少保证2h并且在冷却过程中不能采取任何强制制冷方式。