中药红花水提物的 HPLC-ESI-ITMSn分析

王 蒙,崔培王申 ,张乃峰,孙长海

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

红花又名红蓝花,别名有草红花、刺红花、红花草等,为菊科(Compositae)植物红花 Carthamus tinctorius L.的干燥花,是红花属中唯一的栽培品种,分布广泛,新疆吉木萨尔、河南新乡、四川简阳、云南巍山是我国红花的四个主要产地。红花味辛微苦、性湿 ,归心、肝经,是活血通经,去淤止痛之良药[1～5]。红花的化学成分复杂,先后分得黄酮类,聚乙炔类,吲哚类,甾族类,木质素类,脂肪酸,挥发油 ,烷基二醇类,有机酸类和甾醇类等化合物二百多种。具有扩张血管、增加血流量、改善微循环、抑制血小板聚集、兴奋子宫、降压、抗癌、抗炎等药理活性[6～13]。中药提取方式种类多,多采用水蒸气蒸发回流,能够很好地将红花中有效成分提取出来。液相色谱-电喷雾质谱联用技术有着强大的分离能力和鉴定能力,在天然药物化学成分的分析中具有独特的优势。目前,关于红花的报道已有很多,但从 HPLC-ESI-ITM Sn角度来对中药红花水提物成分鉴定尚未见报道。本文将从此方面入手,建立了中药红花水提物的高效液相色谱-电喷雾离子阱测定方法,为中药红花成分的表征提供了一种新方法,有望在中药质量控制中得到广泛的应用[14～15]。

1 仪器与材料

液相色谱系统(Agilent1200配有 G1312A型四元输液泵、G1367A型自动进样器、G1316A型柱温箱、和 G1322A型脱气机,G1315D型 DAD检测器)离子阱质谱仪(G6310,美国 Agilent公司)。甲醇 (色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);甲酸(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);娃哈哈纯净水。中药红花(购于佳木斯市新药特药医药有限公司)。

2 实验方法

2.1 色谱与质谱条件

Agilent EC-C18色谱柱 (4.6 mm× 100mm,2.7 μm);SC GeminiC18保护柱 (5mm× 2.1mm,1.7 μm);柱温 25℃ ;二元线性梯度洗脱:流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱:0～2minA相保持95%,2～10min线性变化至 35%A相,10～ 25min线性变化至 100%A相,保持 5min。流速为0.6mL˙min-1,样品进样量为 40μL。

质谱条件:毛细管温度325℃,毛细管电压13V,氮气为鞘气和辅助气,鞘气流速 10mL˙min-1,辅助气流速 0.15mL˙ min-1,氦气为碰撞气进行碰撞诱导解离分析,扫描范围 m/z 100～ 1100,正离子模式下进行二级离子全扫描。

2.2 中药水提物的制备

称取干燥至恒重红花药材100g,以10倍量蒸馏水浸泡30min,加热回流提取 2h,用蒸馏水补足失重,摇匀,滤过,取续滤液,经0.22μm微孔滤膜滤过 ,即得红花水提物溶液,4℃冰箱冷藏备用。

3 结果与讨论

3.1 色谱与质谱条件的选择

在 HPLC-ESI-ITM S分析中,离子化模式的选择以基峰的强度为依据,为了确定离子化模式,中药红花水提物分别在 ESI离子源下正负离子模式下测定其质谱。在两种离子化模式下,正离子的基峰强度明显大于负离子的强度,所以选择 ESI正离子模式扫描来研究中药红花的成分。

基于峰型的对称性和峰的分离性,色谱条件经反复优化。在实验中分别选用了甲醇/甲酸水和乙腈 /甲酸水来试验,前者响应值较高,并且能够较好的将红花水提物的成分洗脱出来 ,谱峰得到了很好的分离。所以本实验选择甲醇 /甲酸水作为流动相。

3.2 利用 HPLC-ESI-ITMS分析红花水提物的成分

中药红花化学成分极其复杂,包括黄酮类,聚乙炔类,吲哚类 ,甾族类,木质素类,脂肪酸,挥发油 ,烷基二醇类,有机酸类和甾醇类等多种化学成分。目前,针对中药化学成分的研究,首先经过色谱分离,再利用 DAD检测器进行紫外光谱实时检测,但一些物质无紫外吸收或紫外吸收弱,应用质谱技术能很好的解决。它对中药的多种成分均能够检测,且有较好的响应。因此,利用 HPLC-ESI-ITM S分析中药红花是一个可行的方法。

中药红花水提物的正离子检测模式下的一级总离子流图,如图 1所示。列出了36个主要组分的分子量、保留时间和二级碎片 ,见表1。通过质谱库进行检索,参考有关文献资料,定性了10个化合物。

图1 正离子检测方式下红花药材一级全扫描色谱图

3.3 鉴定化合物

由于 HPLC-ESI-ITM Sn能够同时提供化学成分的质荷比、保留时间、二级碎片等信息,被视为鉴定化合物的一种有力工具。所以,与已有红花文献报道相结合,通过相应质谱信息初步定性了中药红花中的10种化合物:芹菜素、花生酸、月桂酸、阿魏酸、杨梅素、豆甾醇、丁二酸、山奈酚、羟基红花黄色素 A、山奈酚-3-O-芸香糖苷。

表1 红花水提物主要化学成分

15 329.3 6.5 327.1、 269.9、 167.0 16 619.5 6.5 600.0、 438.2、 276.2 17 152.1 6.6 135.1、110.1 18 阿魏酸 C10H10O4 194.19 6.7 175.0、151.1、110.0 19 254.4 6.7 237.1、195.0 20 杨梅素 C15H10O 318.0 7.4 317.0、273.0、203.0 21 豆甾醇 C29H48O 412.69 8.4 383.1、322.1、251.1 22 丁二酸 HOOCCH2CH2COOH 118.09 9.0 103.0、70.2 23 397.6 9.9 367.1、 277.1、 235.0 24 山奈酚 C15H10O6 286.23 10.1 284.1、227.1、184.9 25 羟基红花黄色素 AC27H32O16 612.5 10.8 595.0、451.0、331.2 26 514.6 11.2 497.1、 451.1、 351.1 27 419.6 11.8 373.2、 305.7、 273.0 28 351.5 11.9 348.1、 281.0、 231.1 29 山奈酚-3-O-芸香糖苷C27H30O15 594.52 12.0 576.9、 433.0、 397.0 30 603.1 12.6 584.1、 552.9、 486.1 31 637.7 13.0 619.1、 517.0、 473.0 32 928.4 13.4 909.8、 814.7、 701.7 33 589.7 13.5 577.2、 475.1、 441.2 34 607.9 13.6 587.3、 460.2、 403.2 35 688.9 13.7 671.2、 596.3、 513.2 36 769.7 14.9 750.3、 649.2、 592.2

4 结论

本文建立了用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法定性分析中药红花水提物中的多种化学成分,利用液质联用技术无需衍生化,直接通过多级质谱进行结构鉴定的优点,结合文献报道采用该法鉴定了10个化合物,每个化合物均具有较高的灵敏度,为同时快速分析中药多个化学成分提供了有效手段。

[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典 [M].北京:化学工业出版社,2005,44-45

[2]宋金春,胡传开,曾俊芬,等.红花的 HPLC指纹图谱研究[J].中国药学杂志,2005,40(18):1378

[3]赵明波,邓秀兰,王亚玲,等.红花 RP-HPLC指纹图谱的建立及其质量研究 [J].药学学报,2004,39(3):212

[4]Fan Li,Zhao Hai-Yu,Xu Man,et al.Qualitative evaluation and quantitativ e determination of10 majoractiv e components in Carthamus tinctorius L. by high - performance liquid chromatography coupled with diode array detector[J]. J Chromatogra A,2009,12(16):2063

[5]Yin HB,He ZS.A nov ol semi- quinone chalcone sharing apyrrolering C-glycoside from Carthamus tinctorous [J],Tetrahedron lett,2007,41(12):1955

[6]范莉,濮润,赵海誉,等.红花药材的 HPLC指纹图谱及质量研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(1):38-39

[7]赵文丽,姜庆久,吴影.红花对实验性大鼠肝纤维化的抑制作用[J].黑龙江医药科学,2004,27(4):4-5

[8]王淑君,王万铁,熊建华,等.红花注射液对实验性脑缺血再灌注损伤中一氧化氮和内皮素的影响 [J].中国急救医学,2003,23(5):298-299

[9]金哗,徐东明,徐伟瓶.红花注射液综合治疗对慢性肺心病急性期血液流变学的影响 [J].中国中西医结合杂志,2005,20(6):430-432

[10]张明霞,李效忠.红花抗衰老作用的实验研究 [J].中草药,2006,32(1):52-54

[11]Fan L,Zhao HY,Xu M,et al. Qualitative evaluation and quantitative determination of 10 major active components in Carthamus tinctorius L. by high - performance liquid chromatography coupled with diode array detector[J]. J Chromatog r A,2009,1216(11):2063

[12]廖晖,郝一彬.红花注射液对急性心肌缺血大鼠的保护作用及机理探讨 [J].中国药房,2003,(145):269

[13]金鸣,李金荣,吴伟.羟基红花黄色素 A抗氧化作用的研究 [J].中草药,2004,35(6):665

[14]张戈,郭美丽,张汉明,等,红花的化学成分研究 [J].第二军医大学学报,2005,23(1):109-1101

[15]张戈,郭美丽,李颖,等.红花的化学成分研究 [J].第二军医大学学报,2005,26(2):220-2211