运用量子化学方法解析大黄酚 ESI-ITMSn中质谱行为

崔培王申,张乃峰,王 蒙,方洪壮

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

电喷雾离子阱质谱是近几年来迅速发展并完善起来的一种软电离质谱,其离子化条件温和、谱图简单,特别适用于极性大等天然化学成分的分析。电喷雾离子阱质谱具有高灵敏度、高特异性,其一级质谱图主要产生准分子离子峰,而多级质谱能够提供该化合物的结构信息[1～7]。化合物质谱裂解过程中大多数是单分子离子的分解反应,可借助量子化学计算解析化合物分子及其碎片离子的结构以及研究和阐明化合物质谱中的裂解机理。目前,关于蒽醌类化合物大黄酚的质谱分析的研究虽有很多[8～10],但从分子水平上对大黄酚分子的质谱特征的量子化学计算的研究尚未见报道。本文对电喷雾离子阱质谱下的大黄酚分子及其碎片离子进行了量子化学计算,研究其质谱碎片结构特点和其质谱中断裂位点及质谱裂解途径。实验结果为大黄酚构效关系及药物分子合成提供理论依据,并可为解释其它蒽醌类化合物电喷雾离子阱质谱裂解机理提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

安捷伦 G6310质谱仪:美国 Agilent公司产品,配有电喷雾离子源(ESI)和 DataAnalysis数据处理系统;流动注射泵:美国 Agilent公司产品。大黄酚对照品 (批号:110796-200310)购自于中国药品食品检定研究院,色谱级甲醇购自于天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 质谱条件

流动注射泵进样流速5μL˙min-1,毛细管温度325℃ ,毛细管电压13V,氮气为鞘气和辅助气,鞘气流速10mL˙min-1,辅助气流速0.15mL˙min-1,氦气为碰撞气进行碰撞诱导解离分析,扫描范围 m/z 100～ 400,负离子模式下手动提取离子方式依次改变质谱的碎裂电压 (0.1～1.5V)进行多级离子全扫描。

1.3 理论模型与计算方法

首先用半经验量子化学计算 AM1方法获得所有分子及碎片离子的初始几何构型,然后依据密度泛函理论,在B3LYP/6-31G(d)水平,对大黄酚的各级质谱碎片离子进行了几何结构优化及频率计算,确定了各碎片离子的稳定结构,用 ROB3LYP/6-31G(+)(2d,2p)方法,计算形成各碎片离子所需的能量,确定大黄酚分子的活性断裂部位,进而推导出大黄酚的质谱裂解途径。量子化学计算均采用Gaussian 03程序完成。各碎片离子的键断裂能(Bond dissociation energy,BDE)用下式计算得到:

式中,E(RX)为母碎片离子的总能量(Total energy,TE),E(R)为脱去取代基后子离子碎片的能量,E(X)为取代基的能量 [11～15]。

2 结果与讨论

2.1 大黄酚质谱数据的初步分析

大黄酚分子结构如图1所示,其结构位次编号由软件给定。大黄酚 CIDMS质谱实验结果如图 2所示。大黄酚在串联质谱碎裂过程中 ,经历了脱 H、脱 O、脱 CO2、缩环丢失中性CO小分子等过程。

2.2 大黄酚准分子离子的分析

2.2.1 能量分析

大黄酚准分子离子可能的初始结构进行几何结构优化、频率计算及相应的能量计算,确定了准分子离子的稳定结构。大黄酚准分子离子初始构型可能为失去15位氢、18位氢的2个体系。结果表明,2个体系的自旋污染 S2值均与理想特征值0.7500匹配较好,优化后的最终结果均符合收敛标准(Maximum Force 0.000450;RM S Force 0.000300;Maximum Displacement 0.001800;RMS Displacement 0.001200),频率计算均未发现虚频,说明各体系构型稳定正确。能量计算表明,大黄酚分子失去15位氢(-877.9478 hatree)比失去18位氢 (-877.9689hatree)高,18位上失去氢形成准分子离子是热力学择优结果。

2.2.2 几何分析

图3为大黄酚准分子离子体系的初始立体构型。大黄酚准分子离子的几何结构进行优化及频率计算结果表明,整个准分子离子体系 A、B、C三环均为近平面结构,并且各环所连的取代基均在此平面内呈自由伸展状态存在。

图3 大黄酚准分子离子的几何结构

2.3 大黄酚 M S2质谱碎片离子的解析

大黄酚准分子离子质荷比252.9为母离子进行手动二级扫描,获得碎片离子如图4所示 ,主要产生 237.9和224.9的碎片离子。

图4 大黄酚的手动二级质谱图

2.3.1 237.9的碎片离子解析

根据 CIDM S推测分析,该碎片离子从准分子离子的体系上脱去质量数为15的基团,此基团为-CH3。C环上的甲基呈自由伸展状态,受空间位阻较小在裂解过程易断裂。对质荷比252.9的母离子进行几何构型优化,得出各个原子的几何参数,从键长角度来分析,其准分子离子 C12～C22的键长为0.15108nm比大黄酚分子的0.14259nm明显变长,故易断裂。

2.3.2 224.9的碎片离子解析

碎片离子224.9是大黄酚准分子离子的主要产物,其丰度可达100% ,与大黄酚质量数相差28,丢失的基团显然为CO。大黄酚脱去一个氢形成准分子离子过程中,C环的电荷发生离域性变化,优化后结果显示14位上的酚羟基由 C-O变成 C=O双键。大黄酚准分子离子的7位、10位羰基以及 6位上的酚羟基均具有较强的活性,在此确定碎片离子224.9的构型将十分必要。分别将6、7、10、14位失去 CO之后的体系记作 A6、 A7、 A10、A14,能量计算结果见表 1,10位 失去 CO所需的键断裂能最小 ,故本次裂解发生在10位上。

2.4 质荷比224.9的碎片离子MS3质谱解析

以质荷比224.9作为母离子,改变其碎裂电压,获得质荷比为 209.9、196.9、180.9的碎片离子,在此次裂解过程中分别发生脱 CH3、CO、CO2中性小分子的中性丢失。

图5 碎片离子224.9的三级质谱图

表1 224.9的碎片离子可能体系的键断裂能

(1)碎片离子209.9。本次裂解丢失质量数为15的碎片离子,而碎片离子 224.9的结构中仅存在一个甲基,本次裂解就发生此位点上。(2)碎片离子196.9。该碎片离子的形成主要是脱去 CO中性小分子,可能发生脱去反应的位置在6、7、14号位 ,对可能形成的3个体系进行能量计算,经计算6号位失去 CO的键断裂能为0.0651 hatree,7号位失去 CO的键断裂能为0.1416 hatree,14号位失去 CO的键断裂能为0.0376 hatree,14号位发生反应所需能量较少所以容易在此位点上反应。(3)碎片离子180.9。本次裂解丢失质量数为44,显然是CO2,但是从碎片离子224.9的结构上分析 ,未发现有羧基之类的基团存在,推测此次裂解应该是分步进行的,根据母离子的结构分析,主要存在两种裂解方式:① 先 CO后 O(196.9→ 180.9);② 先 O后 CO(208.9→ 180.9)。采取方式①时应在 196.9的碎片离子中存在质荷比 180.9的碎片离子,但对其进行扫描未发现,故排除此方式。碎片离子224.9在离子阱内先形成不稳定碎片离子208.9,受高电压的影响瞬间裂解丢失 CO小分子,以方式②裂解将成为可能。运用量子化学计算各原子的自旋密度,发现 O18(0.301464)的自旋密度为所有氧原子中最大,将在反应中易失去。同时对所形成的结构进行能量计算,发现6号位失去 CO为热力学择优结果,可见方式②的推测是正确的。

2.5 大黄酚的 M S4质谱解析

大黄酚的三级质谱主要产生质荷比209.9、196.9、180.9的碎片离子,分别将其作为母离子进行四级裂解,所得结果见图2。(1)质荷比209.9的后续离子。209.9的碎片离子主要有两种裂解方式产生:① 253.0→237.9→ 209.9;② 253.0→224.9→ 209.9。分别以质荷比209.9作为母离子按两种方式进行不同碰撞电压下的四级质谱扫描,经实验结果表明,在此次裂解中仅产生质荷比181.9的碎片离子,并且两种方式出现此碎片离子的碰撞电压是相同的,可以判定两种方式下碎片离子209.9的结构是相同的。由质荷比209.9裂解到质荷比 181.9失去质量数为28的基团,通过 CIDMS分析表明,此次裂解为 CO中性小分子的丢失。能量结果表明,失去6号位的酚羟基所用能量为0.1415hatree;失去7号位的羰基的键断裂能为0.2265hatree;失去14号位的羰基的键断裂能为0.4383 hatree,经比较失去6号位的酚羟基为此次裂解的反应位点。(2)质荷比196.9的后续离子。以196.9为母离子进行不同碎裂电压的扫描,主要发现质荷比 168.9和181.7的碎片离子,分别失去质量数为28和15的基团,根据碎片离子 196.9的分子构型分析,失去质量数为28的基团很可能是在6号位和7号位上发生脱羰基缩环反应,运用量子化学方法在UB3LYP/6-31G(d)水平上计算电荷变化以及自旋密度,结果发现,部分电荷的变化如下:C7(0.346→ 0.336)、O23(-0.457→ -0.456)、 C6(0.409→ 0.250)、O15(-0.568→-0.648),从数据可以看出 C7、O23变化不大,C6、O15的电荷变化较大可以初步判断此次裂解发生在 C6和 O15的基团上。从自旋密度分析,碎片离子 196.9中 C7(-0.02494)、O23(0.08146)均比 C6(-0.073013)、O15(0.266026)的自旋密度小,进一步说明了 C6和 O15是本次反应的活性中心。质荷比181.7的碎片离子很明显是由196.9失去 22号位上的甲基形成的。(3)180.9的后续离子。结合碎片离子180.9的离子构型可知,质量数由180.9到153.1变化了约28,此次反应是在 7号位失去 CO形成的。

3 结论

本文运用量子化学方法来解析大黄酚分子在离子阱电喷雾质谱中的裂解规律,依据密度泛函理论,采用 B3LYP/6-31G(d)方法计算质谱碎片离子的几何参数、电荷变化、自旋密度以及 ROB3LYP/6-31G(+)(2d,2p)水平下键断裂能的计算,经综合分析,获得的大黄酚的主要碎片离子 m/z:252.9、 237.9、 224.9、209.9、 196.9、 181.9、 180.9、 168.9、153.1的稳定结构以及裂解方式与 CIDMS所推断的裂解规律相吻合,成功地解释了大黄酚分子在 ESI-ITMS中裂解现象。

[1]越皓,皮子凤,刘淑莹,等.电喷雾质谱分析附子炮制中的化学成分变化 [J].分析化学,2007,35(7):956-963

[2]王勇,刘志强,刘淑莹,等.白山草乌中二萜生物碱的电喷雾串联质谱分析 [J].质谱学报,2002,23(3):160-163

[3]王鹏远,吴彩胜,张金兰.HPLC-UV-FTICRM S/MSn法分离鉴定葛根素原料药中 4种有关物质 [J].质谱学报,2010,31(3):143-151

[4]董红娟,刘志强,刘淑莹,等.芍药苷的电喷雾串联质谱研究[J].高等学校化学学报,2006,11(27):2066-2069

[5]Ma JJ,Kang LP, Zhou WB, etal. Identification and characterization of saponins in ex tract of Ziziphi spinosae Semen(ZSS) by ultra- performance liquid chromatographyelectrospray ionization- quadrupole time- of- flight tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-QTOF-M SE)[J].J M ed Plants Res,2011,5(26):6152-6159

[6]Justino GC,Borges CM,Flor ê ncio M H.Electrospray ionization tandem mass spectrometry frag mentation of protonated flavone and flavonol aglycones:a re-examination[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2009,23(2):237-248

[7]Vessecchi R,Emery FS,Galembeck S E,et al. Electrospray ionization tandem mass spectrometry fragmentation of protonated flavone and flavonol aglycones: a re- examination[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2010,24(2):2101-2108

[8]董静,王弘,万乐人,等.高效液相色谱 /电喷雾-离子阱-飞行时间质谱分析鉴定中药虎杖的中药主要化学成分 [J].色谱,2009,27(4):425-430

[9]马小红,沈少林,韩凤梅,等.大黄蒽醌类化合物电喷雾质谱研究[J].湖北大学学报,2006,28(4):403-405

[10]董静,王弘,陈世忠,等.蒽醌类化合物的电喷雾串联质谱研究[J].第九届全国中药和天然药物学术研讨会大会报告及论文集,2007,12:48-55

[11]陈兰慧,金莲姬,苏忠民,等.乌头碱类生物碱电喷雾串联质谱行为及碎片离子稳定性的量子化学计算[J].高等学校化学学报,2005,26(12):2340-2344

[12]陈兰慧,胡冬华,刘淑莹.小檗碱质谱碎片离子稳定性分析及碎裂机理的量子化学研究 [J].高等学校化学学报,2006,(27):905-908

[13]梁艳,于世峰,陈卫军,等.山奈酚的电喷雾质谱裂解途径 [J].应用化学,2009,26(10):1250-1252

[14]罗小,欧阳永中,梁逸曾,等.通过确定初始电力位点预测吲哚类生物碱质谱的特征裂解规律 [J].高等学校化学学报,2010,(8):1522-1528

[15]洪波,仇永清.附子中双酯型乌头碱类成分水解减毒机理的密度泛函理论研究 [J].分子科学学报,2008,24(3):216-219