增生性瘢痕和正常皮肤组织中TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的比较

姜春英 ，刘德明 ，刘德伍 ，彭 燕 ，宋志芳 ，宁 璞

（南昌大学a.第一附属医院烧伤中心；b.医学院解剖教研室，南昌 330006）

增生性瘢痕系由各种创伤后成纤维细胞过度增殖、细胞外基质无序沉积所致，多发于深及真皮的创伤。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）作为体内重要的具有多功能生物学活性的细胞因子，在创伤修复、脏器纤维化、炎症性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤中都具有重要意义[1]。TGF-β1 是最重要的促瘢痕形成因子[2]。 有研究[3]表明，瘢痕纤维化的主要病理学改变是细胞外基质的沉积，细胞外基质的主要成分是Ⅰ型胶原，也含有Ⅲ型胶原。本实验采用免疫组织化学法观察人增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达的变化，探讨其在增生性瘢痕的形成和演化过程中的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器及试剂

全自动脱水机（德国Leica公司）、石蜡包埋机、轮转式切片机、烘片机、电热鼓风恒温烤箱、显微镜（日本 Olympus公司）。兔抗 TGF-β1（美国 Proteintech公司），Collagen TypeⅠ一抗、Collagen Type Ⅲ一抗（武汉博士德生物工程有限公司），PV9000通用二步法试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.1.2 组织标本收集

选择2012年2月至2013年2月南昌大学第一附属医院烧伤整形科住院的患者10例，年龄20～30岁，均未接受药物治疗和放射治疗，手术时间为创面愈合后4～12个月。经医院伦理委员会批准、患者本人及家属知情同意，取其整形手术切除的增生性瘢痕及其邻近的正常皮肤组织。

1.2 实验方法

将瘢痕组织和瘢痕边缘正常皮肤组织修除表皮和皮下组织，分别置于10%甲醛中固定12 h，石蜡包埋，经常规组织切片脱蜡至水后，分别采用兔多克隆抗体 Collagen TypeⅠ、Collagen TypeⅢ、TGF-β1一抗，采用免疫组织化学SP法进行检测，实验操作均按试剂盒说明书进行，其具体步骤如下：1）石蜡切片，厚度均取 3 μm，65 ℃烤片 30 min；2）常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ 各5 min，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡3 min，PBS冲洗；3）抗原热修复（柠檬酸缓冲液加热至98℃）5 min，每5～10 min修复1次，让其自然冷却；4）3%H2O237℃ 去离子水孵育 5 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗 3×5 min；5）置于0.01 mol·L-1、pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中行抗原热修复 15 min，PBS 洗 3×5 min；6）滴加 Collagen TypeⅠ、Collagen TypeⅢ、Smad2、TGF-β1 一抗，4 ℃过夜，PBS洗 3×5 min；以PBS代替一抗作为阴性对照；7）滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育15 min，PBS 洗 3×5 min；8）DAB 显色 5～10 min，PBS 洗 3×5 min；9）苏木精复染，盐酸乙醇分化；10）吹干后中性树脂封片；11）通过光学显微镜观察免疫组织化学结果，以细胞呈棕黄色染色为阳性表达。

2 结果

免疫组织化学结果显示：在增生性瘢痕组织中，TGF-β1在表皮细胞、真皮层中成纤维细胞及部分炎症细胞等胞浆中呈棕黄色颗粒表达（封四图1）；正常皮肤组织中 TGF-β1低表达（封四图 2）。在增生性瘢痕组织中，Ⅰ型胶原染色呈棕黄色颗粒，细胞外基质显示出棕黄色纤维（封四图3）；在正常皮肤组织中Ⅰ型胶原呈低表达（封四图4）。Ⅲ型胶原染色呈棕黄色颗粒，细胞外基质显示出棕黄色纤维（封四图5）；正常皮肤组织中Ⅲ型胶原呈低表达（封四图6）。人增生性瘢痕组织中 TGF-β1，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达均显著高于正常皮肤组织。

3 讨论

尽管治疗增生性瘢痕的方法有很多种，但其疗效难以让人满意[4]。近几年，国内外关于探究增生性瘢痕形成的内在机制的研究层出不穷[5]。目前认为，增生性瘢痕的发生机制主要为皮肤组织成纤维细胞的过度增生和活化，而成纤维细胞的过度增生活化打破了胶原合成和基质降解之间的平衡，导致了纤维蛋白、黏多糖及皮肤胶原的过度沉积。提示，增生性瘢痕的防治应从源头上避免或减轻异常瘢痕的发生、发展。

TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原作为调节细胞增殖、发育及分化的重要分子，可能在增生性瘢痕的形成中发挥了重要的作用[6]。本实验采用免疫组织化学SP法检测增生性瘢痕与正常皮肤组织中TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，结果显示：TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原在增生性瘢痕组织中含量明显高于正常皮肤组织。提示，其在增生性瘢痕形成和演化过程中可能发挥靶点效应。如能针对TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原进行干预和调控，有望在增生性瘢痕的防治中发挥积极的作用。

[1] 高春芳.TGFβ1基因变异与疾病相关性研究展望[J].世界华人消化杂志,2007,15（28）:2959-2965.

[2] Abe M,Yokoyama Y,Ishikawa O.A possible mechanism of basic fibroblast growth factor-promoted scarless wound healing:the induction of myofibroblast apoptosis[J].Eur J Dermatol,2012,22（1）:46-53.

[3] Massague J.How cells read TGF-beta signals[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2000,1（3）:169-178.

[4] Reish R G,Eriksson E.Scar treatments：preclinical and clinical studies[J].J Am Coll Surg,2008,206（4）:719-730.

[5] 杜飞亚,谈伟强.瘢痕的形成机制及治疗研究进展[J].全科医学临床与教育,2010,8（5）:528-530.

[6] Gressner A M,Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets[J].J Cell Mol Med,2006,10（1）:76-99.