鸡肉生产链空肠弯曲杆菌的耐药性研究

韩新锋，刘书亮，2，陈 荀，侯小刚，周 康，吴聪明

2.农产品加工及贮藏工程四川省重点实验室，雅安625014；

3.中国农业大学动物医学院，北京 100193

空肠弯曲杆菌（Campylobacterjejuni，C.jejuni）是一种人兽共患病原菌，也是一种主要的食源性感染病原菌，广泛存在于各种动物体内，尤以家禽、家畜和野禽带菌最多，主要通过动物、食物、水等途径传播，可引起急性、自限性胃肠炎，严重的可导致格林－巴利综合征、急性神经肌肉瘫痪及反应性关节炎等疾病。有研究报道空肠弯曲杆菌的感染率超过了沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌O157∶H7［1－2］，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。在发展中国家，空肠弯曲杆菌是婴幼儿感染性腹泻最多见的病原菌。在我国，空肠弯曲杆菌也是主要的腹泻病原菌之一［3］。

国内对空肠弯曲杆菌的研究主要集中在病原分离鉴定以及快速检测方面。随着各种抗菌药物在集约化养殖过程的广泛使用，空肠弯曲杆菌的耐药性逐渐增强，耐药谱不断扩大，有关空肠弯曲杆菌的耐药性成为研究热点。耐药性空肠弯曲杆菌可以通过受污染的食品进入人体，此外，耐药性还可以转移给人体内其它细菌，使得空肠弯曲杆菌的感染难以控制，直接威胁人类健康。对空肠弯曲杆菌耐药性的研究多局限于表型方面，少数研究深入到基因水平。而关于食品生产链（养殖场－屠宰场－超市和市场）中空肠弯曲杆菌的分布情况、耐药性及传播情况的研究尚未见报道。

本研究旨在分析鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌分离株的耐药性情况，为养殖环节和相关机构制定抗菌药管理政策和措施以及空肠弯曲杆菌的耐药性安全评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 参照 GB/T 4789.9－2008方法，从四川省成都市、雅安市养鸡场粪样、屠宰加工厂鸡粪样和鸡肉样、市场抽取的鸡肉样共519份样品中分离鉴定出空肠弯曲杆菌（C.jejuni）180株。空肠弯曲杆菌（C.jejuni）ATCC33560、大肠杆菌（E.coli）ATCC25922、金黄色葡萄球菌（S.aureus）ATCC29215、沙门氏菌（Salmonella）H 9812作为参考菌株，由四川农业大学食品微生物实验室保存。

1.1.2 培养基 哥伦比亚琼脂培养基；M－H培养基和布氏肉汤临用前加入5%牛血清。

1.1.3 试剂 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、10×PCR buff－er、25 mmol/L MgCl2、d NTP mixture（各2.5 mmol/L）、引物、Gold View核酸染料、DNA Marker DL2000均购自宝生物工程（大连）有限公司。红四氮唑（TTC）购自上海灵锦精细化工有限公司。其他均为常规化学试剂。

1.1.4 药物 硫酸红霉素（ERY），购自河南保利平原药业有限责任公司；盐酸环丙沙星（CIP）、左氟沙星（LEV）购自浙江新华制药有限公司；硫酸庆大霉素（GEN），购自邯郸滏荣制药有限公司；氟苯尼考（FLO），购自宁夏太平洋生物制药有限公司；硫酸链霉素（STR）、盐酸克林霉素（CLI），盐酸四环素（TET），由课题组统一提供。

1.1.5 主要仪器 SW－CJ－1F洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），3111二氧化碳培养箱（Thermo），MyCycler PCR仪（Bio－Rad），PowerPac Basic电 泳仪及水平电泳槽（Bio－Rad），凝胶成像系统（Bio－Rad）等。1.2 方法

1.2.1 药液的配制 按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准［4］进行药液配制，将药物制成浓度为5 120μg/m L的储藏液，－20℃保存，使用时将储藏液稀释为512μg/m L的应用液。

1.2.2 药敏盒的制备 向无菌96孔板各孔中加入100μL含10%新生牛血清的M－H肉汤液，然后向第1孔中加入抗菌药物应用液100μL，按二倍系列稀释法稀释，制成微量稀释药敏盒。做好的药敏盒如不立即使用，需在4℃存放。

1.2.3 药敏试验 根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准方法进行［4］。挑取纯培养的单个菌落接种到M－H肉汤，置于二氧化碳培养箱中，42℃微需氧环境培养48 h。将培养的菌液稀释至0.5麦氏比浊管（0.2 mL 0.25%BaCl2和9.8 m L 1%H2SO4）后，再用 M－H肉汤稀释至菌液含量为1×106CFU/m L。向制备好的药敏盒各孔中加入稀释菌液100μL，37℃微需氧条件下培养48 h。加0.5%的TTC试剂1～2滴，继续培养30 min后观察结果，记录对各种药物的最低抑菌浓度值（MIC）。以空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 33560为质控菌株。

参考CLSI（2010）和文献［5－6］，空肠弯曲杆菌分离株对某种抗菌药物的MIC值不低于表1中标准的判定为菌株对该药物耐药。

1.2.4 MAMA PCR引物设计 以空肠弯曲杆菌DNA促旋酶（gyrA）基因的喹诺酮类耐药决定区（QRDR）作为靶序列，根据Zirnstein［7］等设计的引物略做改进。引物序列如下：P1 5′－TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT－3′，P2 5′－CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA－3′，P3 5′－CAG TAT AAC GCA TCG CAG－3′。其中P1、P3为保守引物，预期扩增产物大小为368 bp；P2为检测突变位点的错配引物，如P2 3′末端结合的模板DNA碱基发生点突变，则P1和P2预期扩增片段大小为265 bp，如未发生突变，则不能扩增出该条带。

表1 空肠弯曲杆菌的药敏试验耐药判定标准Tab.1 Resistance breakpoints applied for the interpretation of susceptibility test of C.jejuni

1.2.5 DNA模板的制备 挑取哥伦比亚血琼脂培养基上的纯培养物于布氏肉汤中培养48 h，取1.5 m L培养液于2 m L EP管中，12 000 r/min常温离心2 min，弃上清液。向其中加入800μL p H8.0 TE，12 000 r/min常温离心1 min，去上清。重复一次上述离心步骤后，用80μL TE重悬沉淀，放入100℃沸水中煮沸10 min。取出置于冰水浴中冷却5 min后，12 000 r/min离心3 min，上清液置于－20℃保存备用。1.2.6 PCR扩增 通过预试验优化PCR体系配比和循环参数后，PCR反应体系确定为：10×PCR buffer 5μL，MgCl24μL，d NTPs 4μL，模板DNA 2μL，引物P1 0.8μL、P2 0.4 μL、P3 0.4μL、Taq酶1μL，补水至50μL。循环参数设定为：94℃，5 min；94℃，30 s，49℃，30 s，72℃，30 s，30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.7 PCR产物电泳分析 用0.5×TBE配制1.5%的琼脂糖凝胶，加热溶解、凝固后，放入电泳缓冲液中，取5μL PCR扩增产物与1μL上样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶孔中。电泳参数：电压100 V，时间50 min。凝胶成像系统拍照、分析电泳结果。

1.2.8 序列测定 随机取两株突变菌株和两株非突变菌的MAMA PCR产物送至宝生物工程（大连）有限公司测序。

2 结 果

2.1 耐药性分析 药敏试验结果见表2，在受试的8种药物中，空肠弯曲杆菌分离株对喹诺酮类药物的耐药率最高，对环丙沙星和左氟沙星的耐药率分别为94.44%和93.89%；对四环素的耐药率次之，为 91.67%；对 克 林 霉 素 （78.33%）、红 霉 素（20.00%）、链霉素（20.56%）、庆大霉素（17.78%）、氟苯尼考（12.22%）呈现不同的耐药率；鸡肉生产链每个环节的空肠弯曲杆菌分离株均表现出多重耐药性。

在养殖场中空肠弯曲杆菌对环丙沙星和左氟沙星的耐药率都为100%，对红霉素、庆大霉素和氟苯尼考非常敏感，耐药率为0%；在屠宰场中，空肠弯曲杆菌对四环素和克林霉素的耐药率高于对环丙沙星和左氟沙星的耐药率，对链霉素和氟苯尼考较敏感；从养殖场到屠宰场，空肠弯曲杆菌对红霉素、克林霉素、链霉素、庆大霉素、四环素和氟苯尼考的耐药率明显升高。在市场中空肠弯曲杆菌对环丙沙星和左氟沙星的耐药率均为100%，对庆大霉素的耐药率为0%；从屠宰场到市场，空肠弯曲杆菌对红霉素、链霉素、庆大霉素和四环素的耐药率显著降低，对克林霉素、环丙沙星和左氟沙星的耐药率呈升高趋势。可以看出屠宰场空肠弯曲杆菌的耐药率相对养殖场和市场中空肠弯曲杆菌的耐药率高，总体来讲，从养殖场到市场空肠弯曲杆菌对上述8种药物的耐药率呈持平或上升趋势。

2.2 耐药谱 180株空肠弯曲杆菌对8种药物共产生了15种耐药谱，所有菌株至少耐2种药物（表3），多重耐药菌株（耐3种及以上药物）占91.67%。药敏试验结果显示优势耐药谱（CLI CIP LEV TET）明显，占33.33%；对CIP、LEV和 TET同时耐药的菌株占20%。肉鸡养殖场、屠宰场和市场中空肠弯曲杆菌的耐药谱分别为6种、13种和5种。鸡肉生产的3个环节具有相同的优势耐药谱（CLI CIP LEV TET），在养殖场、屠宰场和市场中分别占30.77%、29.13%和68.00%。在鸡肉生产的3个环节中同时都有耐药谱为CLI CIP LEV TET和CIP LEV TET的空肠弯曲杆菌，表明耐药性空肠弯曲杆菌在鸡肉生产链中可能存在水平传播趋势。2.3 耐喹诺酮类药物基因的MAMA PCR检测

根据MAMA PCR的原理［7］可知，发生突变的菌株能扩增出两条带，而没有发生突变的菌株只能扩增出一条带。本研究利用MAMA PCR技术，检测了137株耐环丙沙星空肠弯曲杆菌的gyrA基因第257位突变情况，结果有131株空肠弯曲杆菌检测结果阳性，扩增出了两条特异性片段，占所检测环丙沙星耐药菌株的95.62%（图1）。10株环丙沙星敏感菌株均没有在该位置检测出点突变，只能扩增出一条带。

2.4gyrA基因耐药决定区测序结果 空肠弯曲杆菌gyrA基因耐药决定区（第61位～360位碱基）测序结果见表4。测序结果表明，环丙沙星耐药菌株MJF31和MJF53都在第257位碱基发生了ACA→ATA（Thr－86→Ile）的突变，而环丙沙星敏感菌株JF9和JF13均未发生ACA→ATA（Thr－86→Ile）的突变。该结果充分说明了MAMA PCR检测喹诺酮类耐药基因点突变的准确性。

表2 鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌分离株的耐药率（%）Tab.2 Resistance rate of C.jejuni isolates from chicken production chain against 8 antimicrobial agents

表3 鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌耐药谱Tab.3 Drug resistance profiles of C.jejuni isolates from chicken production chain

3 讨 论

本研究中空肠弯曲杆菌对环丙沙星、左氟沙星和四环素的耐药率较高，这与近年来我国大量使用喹诺酮类和四环素类药物治疗家禽的腹泻等疾病有关，相比之下氟苯尼考、链霉素和庆大霉素药物在家禽上使用较少，因此，对氟苯尼考、链霉素和庆大霉素较敏感，与姜峰［8］和许海燕等［9］的报道一致。Luangtongkum等研究表明空肠弯曲杆菌对红霉素的耐药率为80%［10］，Jain等报道空肠弯曲杆菌对四环素的耐药率仅为26.5%［11］，与本研究的耐药性试验结果差异较大，原因可能是不同地区治疗动物疾病或在饲料中添加的抗生素的种类和用量标准不同，从而导致空肠弯曲杆菌的耐药性有所差异。空肠弯曲杆菌对各种抗菌药物的耐药性在鸡肉生产链条中存在差异，从养殖场到市场，空肠弯曲杆菌对上述8种抗菌药物的耐药率呈持平或上升趋势，可能是由于这些药物的耐受菌株在相同条件处理时易存活下来或是加工过程中再污染所致。鸡肉生产链3个环节的空肠弯曲杆菌分离株多重耐药性突出，耐3种或3种以上药物的菌株所占比例为91.67%，明显高于国外报道［12］。这可能与国内养殖和临床用药过程菌株受到的选择压力有关。空肠弯曲杆菌分离株表现出较高的多重耐药率，给空肠弯曲杆菌感染的治疗带来了困难，应长期对养殖场和食品源空肠弯曲杆菌的耐药性进行监测，了解其变化趋势，为食品源空肠弯曲杆菌的安全评价提供数据支持。

表4 空肠弯曲杆菌分离株gyr A基因耐药决定区测序结果比较Tab.4 Comparison on QRDR DNA sequences of C.jejuni gyr A gene

喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲杆菌肠炎的首选药物，但由于该类药物在食品动物中的大量使用，使得动物性食品链中空肠弯曲杆菌对喹诺酮类药物的耐药性不断增强。空肠弯曲杆菌gryA基因内喹诺酮耐药决定区（QRDR）产生的DNA突变，是导致喹诺酮类药物耐药的主要原因［7，13－14］，其中gyrA 基因第257位碱基发生C→T突变，导致该位置三联密码子编码的86位氨基酸发生苏氨酸→异亮氨酸（Thr－86→Ile）突变，此种点突变引起的耐药水平最高，是空肠弯曲杆菌对喹诺酮类药物耐药的主要原因之一，可以导致DNA促旋酶结构的改变，从而引起酶空间结构障碍，阻止喹诺酮类药物进入喹诺酮作用区域，或由于无力化学变化干扰喹诺酮类药物—酶—DNA间相互作用，从而产生耐药性。

MAMA PCR最首要的一步是根据已知的突变位点设计合适的引物，其次就是PCR循环条件的优化，最后通过电泳观察即可判断结果［7］。Said等［15］采用MAMA PCR检测对喹诺酮类药物耐药的空肠弯曲杆菌，结果表明对萘啶酸和环丙沙星耐药的89株菌均在gyrA基因第257位发生了突变，其余对环丙沙星和萘啶酸敏感的菌株均没有在该点检测到突变。Sonnevend等［16］利用 MAMA PCR技术对弯曲杆菌的gyrA基因进行分析，结果发现35株对环丙沙星耐药的菌株均在gyrA基因发生了Thr－86→Ile突变。姜毅等［17］利用MAMA PCR技术对15株环丙沙星耐药空肠弯曲杆菌均检测出在gyrA基因第257位发生点突变，其余对喹诺酮药物敏感的菌株均没有检测出此突变。上述MAMA PCR检测结果与耐药表型完全一致。本研究利用MAMA PCR检测了137株对环丙沙星耐药的空肠弯曲杆菌gyrA基因第257位点突变的情况，检出有131株空肠弯曲杆菌在该位置发生了点突变，占环丙沙星耐药菌株的95.62%。其它表型耐药而MAMA PCR检测结果阴性的菌株，原因可能是部分空肠弯曲杆菌在其它突变位点发生了突变引起的耐药，或者是细菌的外排泵作用导致了耐药性的产生。

图1 部分空肠弯曲杆菌分离株gyr A基因MAMA PCR检测电泳图M：DL2000 DNA Marker；C：空 肠 弯 曲 杆 菌ATCC33560；1－56：分离自鸡肉生产链的环丙沙星耐药空肠弯曲杆菌Fig.1 Electrophoresis results for the MAMA PCR products of Campylobacter jejuni isolates from chicken production chainM：DNA Marker DL2000；C：C.jejuni ATCC33560；Lane 1－56：Ciprofloxacin－resistant C.jejuni isolates from chicken production chain

［1］Allos BM.Campylobacterjejuniinfections：update on emerging issues and trends［J］.Clin Infect Dis，2001，32（8）：1201－1206.DOI：10.1086/319760

［2］Alfredson DA，Korolik V.Antibiotic resistance and resistance mechanisms inCampylobacterjejuniandCampylobactercoli［J］.FEMS Microbiol Lett，2007，277（2）：123－132.DOI：10.1111/j.1574－6968.2007.00935.x

［3］Kan B，Wang JW，Jing HQ，et al.Emerging infectious diseases［M］.Beijing：Chemical Industry Press，2004：195－196.（in Chinese）

阚飙，王健伟，景怀琦，等.新发现传染病［M］.北京：化学工业出版社，2004：195－196.

［4］Clinical and Laboratory Standards Institute.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically［S］.8thed，Approved standard M07－A8.Villanova，PA：NCCLS；2009.

［5］Chen X，Naren GW，Wu CM，et al.Prevalence and antimicrobial resistance ofCampylobacterisolates in broilers from China［J］.Vet Microbiol，2010，144（1/2）：133－139.DOI：10.1016/j.vet－mic.2009.12.035

［6］Andersen SR，Saadbye P，Sukri NM，et al.Antimicrobial resistance amongCampylobacterjejuniisolated from raw poultry meat at retail level in Denmark［J］.Int J Food Microbiol，2006，107（3）：250－255.DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2005.04.029

［7］Zirnstein G，Li Y，Swaminathan B，et al.Ciprofloxacin resistance inCampylobacterjejuniisolates：detection ofgyrA resistance mutations by mismatch amplification mutation assay PCR and DNA sequence analysis［J］.J Clin Microbiol，1999，37（10）：3276－3280.

［8］Jiang F.Epidemiological survey and inactivation kinetics model ofCampylobacterjejuniisolates from different origins［D］.Yangzhou：Yangzhou University，2009.（in Chinese）

姜峰.空肠弯曲菌流行病学及在鸡肉低温贮藏过程中失活动力学特征研究［D］.扬州：扬州大学学位论文，2009.

［9］Xu HY，Huang JL，Bao GY，et al.Prevalence and antimicrobial susceptibility ofCampylobacterspp.in diarrhea patients in Yangzhou［J］.Chin J Zoonoses，2008，24（1）：58－62.（in Chinese）

许海燕，黄金林，包广宇，等.扬州市区腹泻人群空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行状况及耐药性分析［J］.中国人兽共患病学报，2008，24（1）：58－62.

［10］Luangtongkum T，Morishita TY，Ison AJ，et al.Effect of conventional and organic production practices on the prevalence and antimicrobial resistance ofCampylobacterspp.in poultry［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（5）：3600－3607.DOI：10.1128/AEM.72.5.3600－3607.2006

［11］Jain D，Sinha S，Prasad KN，et al.Campylobacterspecies and drug resistance in a north Indian rural community［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，2005，99（3）：207－214.

［12］Son I，Englen MD，Berrang ME，et al.Antimicrobial resistance ofArcobacterandCampylobacterfrom broiler carcasses［J］.Int J Antimicrob Agents，2007，29（4）：451－455.DOI：10.1016/j.ijantimicag.2006.10.016

［13］Ruiz J，Goni P，Marco F，et al.Increased resistance to quinolones inCampylobacterjejuni：a genetic analysis ofgyrA gene mutations in quinolone－resistant clinical isolates［J］.Microbil Immunol，1998，42（3）：223－226.

［14］Wang Y，Huang WM，Taylor DE.Cloning and nucleotide sequence of theCampylobacterjujunigyrA gene and characterization of quinolone resistance mutations［J］.Antimicrobial A－gents Chemother，1993，37（3）：457－463.

［15］Said MM，EI－Mohamady H，EI－Beih FM，et al.Detection ofgyrA mutation among clinical isolates ofCampylobacterjejuniisolated in Egypt by MAMA－PCR［J］.J Infect Dev Ctries，2010，4（9）：546－554.

［16］SonnevendÁ，Rotimi VO，Kolodziejek J，et al.High level of ciprofloxacin resistance and its molecular background amongCampylobacterjejunistrains isolated in the United Arab Emirates［J］.J Med Microbiol，2006，55（Pt 11）：1533－1538.DOI：10.1099/jmm.0.46744－0

［17］Jiang Y，Yang FE，Hou JJ，et al.Analysis of antimicrobial resistance ofCampylobacterjejuniand its related genes［J］.Chin J Vet Drug，2008，42（12）：9－13.（in Chinese）

姜毅，杨凤娥，侯建军，等.空肠弯曲杆菌耐药性及其主要相关基因初步分析［J］.中国兽药杂志，2008，42（12）：9－13.