BACTEC MIGT960在结核分枝杆菌药物敏感性试验中的临床研究

陈忠南，赵丽丽，易松林，谭 笑，胡培磊，白丽琼，万康林，谭云洪

2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206

结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。耐药结核病的出现和流行已成为结核病防治领域的难点和关注焦点。传统的药敏试验存在需时过长、操作复杂、不易标准化和自动化等缺点，不能为结核病的临床治疗提供及时、有价值的药物敏感性相关资料［1］。寻求快速、准确、标准的药敏诊断方法是大势所趋。我们采用临床分离的212株结核分枝杆菌菌株，BACTEC MIGT960与传统L－J比例法检测8种一线/二线抗结核药的药敏情况进行了比较分析，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本 ，从2010年12月起连续收集8个月对就诊于湖南省胸科医院的疑似病例的痰标本经L－J培养基和MGIT960液体培养基培养，阳性培养物复均鉴别培养基（PNB/TCH）进行菌种鉴定，确诊为结核病者212例。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 全自动 BA CT ECTM MGIT TM960 TB系统，购置于美国BD公司。（1）MGl T960用试剂分枝杆菌生长指示管 （MGIT），生长添加剂和BACTEc MGIT 960 SIRE试剂盒含SIRE添加剂和4种一线药物：（INH、RFP、SM、EMB）均为 BD公司产品，4种二线药物［CPM、KAN、OFLX、ETH）为sigma产品。各药物在培养基的终浓度参照BD公司《MGIT操作程序指南》［2］（2）L－J方法用试剂L－J法所用对照和含药培养基均为改良罗氏培养基，所用8种药物，其配方和制备按文献［3］配制。

1.3 药物敏感性实验 212例结核分枝杆菌菌株，分别用MGIT960法和L－J比例法进行一线药物敏感性检测。在完成一线药物的药物敏感性实验后，选取90株耐药菌株（对任何一种一线药物耐药）进行二线药物的药物敏感性实验，除去任一方法污染例数进行对比分析。

1.3.1 MGIT 960法 参照 《MGIT操作程序指南》［2］对于一线药物药敏试验，每株结核杆菌准备5支MGIT 960培养管1管为生长对照管，4管为加药管），每管均加人0.8 m L SIRE添加剂，4支加药管各加入SM、INH、RFP和EMB 100μL，然后，每支加药管加入0.5 m L菌悬液（报阳当天为第0 d，报阳第1～2 d的标本直接加原液，3～5 d的标本需用1∶5无菌生理盐水稀释），生长对照管（GCT）加1∶100无菌生理盐水稀释的菌悬液0.5 m L。将准备好的 MGIT管按 GCT、SM、INH、RFI、EMB的顺序放人AST试管架，系统扫描试管架条形码，按照仪器指示位置放入BACTEC MGIT 960仪器；MGIT 960仪器会在4～13 d内，根据Growlh unit值，自动报告耐药与敏感结果。二线药物药敏试验步骤同一线药物，但加药顺序、试管摆放顺序和所出报告的顺序均为GCT、CPM、KAN、0FLX、ETH。

1.3.2 L－J比例法 参照《结核病诊断实验室检验规程》［3］，一线药物药敏试验与二线药物药敏试验分别进行，从报阳第4～5 d的MGIT管（报阳后需置于37℃培养箱）吸取适量菌液于含玻璃珠的无菌小瓶内，漩涡振荡几秒钟，以0.5%吐温－80生理盐水配成1个麦氏比浊浓度，并用生理盐水稀释至10 mg/m L和10 mg/m L的菌悬液，取稀释好的菌悬液分别接种于对照和含药培养基，37℃培养，待菌落长出时观察结果，根据耐药百分比判别：耐药百分比＝（含药培养基的菌落数/对照培养基的菌落数）×100%，若耐药百分比＞l%为耐药（R），≤l%为敏感（S）。

1.3.3 质量控制 一线/二线药物药敏实验的质控，在开展一线/二线药物药敏试验前，首先对中国疾病预防控制中心传染病预防控制所下发的10株质控菌株，每个菌株重复3次试验并将试验结果报中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，只有质控结果符合率≥90%以上，方可开展一线/二线药物药敏实验。

1.4 统计学方法 试验数据使用SPSS11.0软件进行分析处理：培养时间、采用秩和检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。在分析药敏试验结果时，以L－J比例法为判断标准，计算MGIT 960法的敏感度、特异性和准确性，两种方法检测结果的一致性用Kappa检验判别，Kappa值≥0.75，说明两种方法具有较好的一致性，0.75＞Kappa值≥0.4说明两种方法的一致性一般，Kappa值＜0.4说明两种方法的一致性不好。

2 结 果

2.1 MGIT 960法与L－J比例法对半12份标本的药敏结果比较，见表1。

2.2 MGIT 960法与L－J比例法检测时间的比较MGIT 960法完成一线药物药敏试验的平均时间为8d，L－J法规定判读时间为28 d，二者的差异有统计学意义（P＜0.01）（表2），MGIT 960法完成二线药物药敏试验的平均时间为10 d，L－J法规定判读时间为28 d，二者的差异有统计学意义 （P＜0.01）

（表3）。

表1 8种抗结核药物药敏试验结果Tab.1 Comparison on the results between L－J proportional and MGIT960 methods for DST to 8 drugs（strain）

表2 一线药物药敏试验测定所需d数Tab.2 Average time on completion of DST for the first－line drugs（day）

表3 二线药物药敏试验测定所需d数Tab.3 Average time on completion of DST for the second－line drugs（day）

3 讨 论

我国是结核病高耐药国家，耐药结核病的控制将直接关系到我国结核病控制的成效［3］。BACTEC MGIT 960是美国BD公司生产的全自动分枝杆菌快速培养、鉴定、药敏液体培养分析系统，主要用于快速培养和一线药物的药敏检测。目前二线药物的敏感性诊断也被WHO认可并在国外多家结核病参比试验室使用［4］，国内有些省份的结核病参比实验室已在使用MGIT 960进行结核杆菌的快速培养和一线药敏试验，但未见二线药敏的开展。目前我国结核杆菌的耐药情况形势严峻，只开展一线药物敏感试验对复治难治的耐多药病人来说，是远远不够。特对MGIT960一线/二线药物药敏快速检测技术做出以下评价：

（1）MGIT 960法与传统的L－J比例法药敏试验的符合率较好。异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星MGIT 960法的准确性和Kappa值均大于0.75，说明以上7种药物MGIT 960法与传统的L－J比例法药敏试验具有较好的一致性。乙硫异烟胺Kappaa值0.75＞Kappa值≥0.4，说明两种方法的一致性一般，这与赵丽丽等［5］的试验结果基本一致。

（2）MGIT 960法药敏试验的检测时间明显短于L－J比例法药敏时间。MGIT 960法完成一线药物药敏试验的平均时间为8 d，完成二线药物药敏试验的平均时间为10 d，L－J法药敏试验平均时间为30 d。MGIT960法时间上提前近20多天，避免延误病情，提高治疗结核病的效率，从而有效地控制结核病及耐药结核病的传播。

本次临床试验，采用统一的技术方案开展研究，MGIT 960法与传统的L－J比例法药敏试验的符合率及检侧时间结果经与项目省之一辽宁省［6］张娟及国家参比室赵丽丽［5］等的研究比较，取得一致性效果。说明在已开展MGIT 960法一线药敏试验的省份，二线药敏试验值得推广。

综合上述，MGIT 960法具有快速、简便、准确等特点，缺点是仪器价格昂贵，试剂依赖进口。在基层小规模医院MGIT 960不太适用，但在结核病患者较多的大医院，更适合应用全自动的MGIT960仪器，或集中结核病患者，通过批量培养，也能减少患者个人的经济负担。到20世纪80年代后，结核病的病原学快速诊断才取得突破性进展，如BACTEC法的液体快速培养，在欧美等发达国家已获得认证，成为广泛应用的方法［7］。

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