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BACTEC MIGT960在结核分枝杆菌药物敏感性试验中的临床研究

2013-08-21陈忠南赵丽丽易松林胡培磊白丽琼万康林谭云洪

中国人兽共患病学报 2013年2期
关键词:敏感性一致性结核病

陈忠南,赵丽丽,易松林,谭 笑,胡培磊,白丽琼,万康林,谭云洪

2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206

结核病被列为我国重大传染病之一,是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。耐药结核病的出现和流行已成为结核病防治领域的难点和关注焦点。传统的药敏试验存在需时过长、操作复杂、不易标准化和自动化等缺点,不能为结核病的临床治疗提供及时、有价值的药物敏感性相关资料[1]。寻求快速、准确、标准的药敏诊断方法是大势所趋。我们采用临床分离的212株结核分枝杆菌菌株,BACTEC MIGT960与传统L-J比例法检测8种一线/二线抗结核药的药敏情况进行了比较分析,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本 ,从2010年12月起连续收集8个月对就诊于湖南省胸科医院的疑似病例的痰标本经L-J培养基和MGIT960液体培养基培养,阳性培养物复均鉴别培养基(PNB/TCH)进行菌种鉴定,确诊为结核病者212例。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 全自动 BA CT ECTM MGIT TM960 TB系统,购置于美国BD公司。(1)MGl T960用试剂分枝杆菌生长指示管 (MGIT),生长添加剂和BACTEc MGIT 960 SIRE试剂盒含SIRE添加剂和4种一线药物:(INH、RFP、SM、EMB)均为 BD公司产品,4种二线药物[CPM、KAN、OFLX、ETH)为sigma产品。各药物在培养基的终浓度参照BD公司《MGIT操作程序指南》[2](2)L-J方法用试剂L-J法所用对照和含药培养基均为改良罗氏培养基,所用8种药物,其配方和制备按文献[3]配制。

1.3 药物敏感性实验 212例结核分枝杆菌菌株,分别用MGIT960法和L-J比例法进行一线药物敏感性检测。在完成一线药物的药物敏感性实验后,选取90株耐药菌株(对任何一种一线药物耐药)进行二线药物的药物敏感性实验,除去任一方法污染例数进行对比分析。

1.3.1 MGIT 960法 参照 《MGIT操作程序指南》[2]对于一线药物药敏试验,每株结核杆菌准备5支MGIT 960培养管1管为生长对照管,4管为加药管),每管均加人0.8 m L SIRE添加剂,4支加药管各加入SM、INH、RFP和EMB 100μL,然后,每支加药管加入0.5 m L菌悬液(报阳当天为第0 d,报阳第1~2 d的标本直接加原液,3~5 d的标本需用1∶5无菌生理盐水稀释),生长对照管(GCT)加1∶100无菌生理盐水稀释的菌悬液0.5 m L。将准备好的 MGIT管按 GCT、SM、INH、RFI、EMB的顺序放人AST试管架,系统扫描试管架条形码,按照仪器指示位置放入BACTEC MGIT 960仪器;MGIT 960仪器会在4~13 d内,根据Growlh unit值,自动报告耐药与敏感结果。二线药物药敏试验步骤同一线药物,但加药顺序、试管摆放顺序和所出报告的顺序均为GCT、CPM、KAN、0FLX、ETH。

1.3.2 L-J比例法 参照《结核病诊断实验室检验规程》[3],一线药物药敏试验与二线药物药敏试验分别进行,从报阳第4~5 d的MGIT管(报阳后需置于37℃培养箱)吸取适量菌液于含玻璃珠的无菌小瓶内,漩涡振荡几秒钟,以0.5%吐温-80生理盐水配成1个麦氏比浊浓度,并用生理盐水稀释至10 mg/m L和10 mg/m L的菌悬液,取稀释好的菌悬液分别接种于对照和含药培养基,37℃培养,待菌落长出时观察结果,根据耐药百分比判别:耐药百分比=(含药培养基的菌落数/对照培养基的菌落数)×100%,若耐药百分比>l%为耐药(R),≤l%为敏感(S)。

1.3.3 质量控制 一线/二线药物药敏实验的质控,在开展一线/二线药物药敏试验前,首先对中国疾病预防控制中心传染病预防控制所下发的10株质控菌株,每个菌株重复3次试验并将试验结果报中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,只有质控结果符合率≥90%以上,方可开展一线/二线药物药敏实验。

1.4 统计学方法 试验数据使用SPSS11.0软件进行分析处理:培养时间、采用秩和检验,P<0.05表明差异有统计学意义。在分析药敏试验结果时,以L-J比例法为判断标准,计算MGIT 960法的敏感度、特异性和准确性,两种方法检测结果的一致性用Kappa检验判别,Kappa值≥0.75,说明两种方法具有较好的一致性,0.75>Kappa值≥0.4说明两种方法的一致性一般,Kappa值<0.4说明两种方法的一致性不好。

2 结 果

2.1 MGIT 960法与L-J比例法对半12份标本的药敏结果比较,见表1。

2.2 MGIT 960法与L-J比例法检测时间的比较MGIT 960法完成一线药物药敏试验的平均时间为8d,L-J法规定判读时间为28 d,二者的差异有统计学意义(P<0.01)(表2),MGIT 960法完成二线药物药敏试验的平均时间为10 d,L-J法规定判读时间为28 d,二者的差异有统计学意义 (P<0.01)

(表3)。

表1 8种抗结核药物药敏试验结果Tab.1 Comparison on the results between L-J proportional and MGIT960 methods for DST to 8 drugs(strain)

表2 一线药物药敏试验测定所需d数Tab.2 Average time on completion of DST for the first-line drugs(day)

表3 二线药物药敏试验测定所需d数Tab.3 Average time on completion of DST for the second-line drugs(day)

3 讨 论

我国是结核病高耐药国家,耐药结核病的控制将直接关系到我国结核病控制的成效[3]。BACTEC MGIT 960是美国BD公司生产的全自动分枝杆菌快速培养、鉴定、药敏液体培养分析系统,主要用于快速培养和一线药物的药敏检测。目前二线药物的敏感性诊断也被WHO认可并在国外多家结核病参比试验室使用[4],国内有些省份的结核病参比实验室已在使用MGIT 960进行结核杆菌的快速培养和一线药敏试验,但未见二线药敏的开展。目前我国结核杆菌的耐药情况形势严峻,只开展一线药物敏感试验对复治难治的耐多药病人来说,是远远不够。特对MGIT960一线/二线药物药敏快速检测技术做出以下评价:

(1)MGIT 960法与传统的L-J比例法药敏试验的符合率较好。异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星MGIT 960法的准确性和Kappa值均大于0.75,说明以上7种药物MGIT 960法与传统的L-J比例法药敏试验具有较好的一致性。乙硫异烟胺Kappaa值0.75>Kappa值≥0.4,说明两种方法的一致性一般,这与赵丽丽等[5]的试验结果基本一致。

(2)MGIT 960法药敏试验的检测时间明显短于L-J比例法药敏时间。MGIT 960法完成一线药物药敏试验的平均时间为8 d,完成二线药物药敏试验的平均时间为10 d,L-J法药敏试验平均时间为30 d。MGIT960法时间上提前近20多天,避免延误病情,提高治疗结核病的效率,从而有效地控制结核病及耐药结核病的传播。

本次临床试验,采用统一的技术方案开展研究,MGIT 960法与传统的L-J比例法药敏试验的符合率及检侧时间结果经与项目省之一辽宁省[6]张娟及国家参比室赵丽丽[5]等的研究比较,取得一致性效果。说明在已开展MGIT 960法一线药敏试验的省份,二线药敏试验值得推广。

综合上述,MGIT 960法具有快速、简便、准确等特点,缺点是仪器价格昂贵,试剂依赖进口。在基层小规模医院MGIT 960不太适用,但在结核病患者较多的大医院,更适合应用全自动的MGIT960仪器,或集中结核病患者,通过批量培养,也能减少患者个人的经济负担。到20世纪80年代后,结核病的病原学快速诊断才取得突破性进展,如BACTEC法的液体快速培养,在欧美等发达国家已获得认证,成为广泛应用的方法[7]。

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