耐药性木霉T2菌株的筛选、紫外诱变与药剂驯化

尹婷，徐秉良，梁巧兰，古丽君，李荣峰

（甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 甘肃省草业工程实验室中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070）

木霉（Trichodermaspp.）作为一类重要的生防真菌，广泛存在于土壤、空气和植物体表面等生态环境中［1］，具有适应性强，存在范围广和广谱、高效等优点。但目前单独使用生防因子来控制作物病害，往往受到环境条件等因素的干扰，造成田间防治效果不稳定［2］，因此生产上常与杀菌剂混合使用，然而，木霉菌对化学药剂较为敏感，限制了其使用范围和防治效果。因此，深入研究、开发和生产优良木霉菌及进行木霉菌株的耐药性研究，对防治植物真菌病害，促进农业生产具有重要意义。近年来，杀菌剂，特别是高效、内吸、专一性杀菌剂得到了广泛应用［3］，虽然化学农药见效快，防效高，但是它的长期使用会给人类健康带来严重隐患，并且造成生态环境失衡，引发有害生物产生抗药性，导致其他有益生物数量下降、人畜中毒，不利于绿色植保事业的发展［4，5］。随着人类对生态环境及绿色食品的重视，促使人们开展多方面研究以开发高效、低毒、低残留及与环境和谐的生态合理农药［6］。目前，国内对抗真菌药物耐药机制的研究和抗真菌药物的耐药性研究取得了一定的进展，有关木霉耐药性的报道也越来越多。王勇等［2］通过含药培养基的筛选，得到了速克灵抗性拮抗木霉菌株，二者协同使用比单独使用可以更好地防治灰霉病，并研究了最佳配比。为了获得优良的耐药性木霉菌株，需要对野生菌株加以改良。目前的菌株改良手段主要有诱变育种、原生质体融合和遗传改造［7－9］。但直到20世纪80年代，诱变育种技术才真正用于木霉研究［10］，其中，紫外线诱导是一种简便、实用、应用广泛的菌种改良方法。丁中等［11］通过紫外光照射结合使用含药培养基培养得到了3个哈茨木霉腐霉利抗性突变菌株，抗性菌株与亲本菌株相比较，其抗药性提高100倍以上。鲁海菊等［12］用紫外诱变哈茨木霉，通过多菌灵耐药性筛选，获得耐药性菌株，为进一步筛选强根际能力木霉菌株提供了优质材料。田连生等［13］也筛选出对化学杀菌剂腐霉利（商品名称速克灵）有显著抗性的突变性霉菌株UT－4。本研究拟通过耐药性测定和紫外光诱变及药剂驯化培养，以期筛选出能够与杀菌剂混合的木霉菌株。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

深绿木霉（T.aureoviride）T2菌株和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）由甘肃农业大学植物病理学实验室提供。

1.2 供试药剂

供试药剂6种，分别是75%百菌清可湿性粉剂（上海亚泰农资有限公司生产）、80%多菌灵可湿性粉剂（河北益海安格诺农化有限公司生产）、15%三唑酮可湿性粉剂（江苏剑牌农药化工有限公司生产）、65%代森锰锌可湿性粉剂（成都皇牌作物科学有限公司生产）、50%速克灵可湿性粉剂（甘肃农科院植保所新农药开发中心生产）和50%扑海因可湿性粉剂（拜耳作物科学公司生产）。

1.3 试验方法

1.3.1 耐药性测定 试验于2010年7月实施，重复进行3次。采用含毒介质培养方法［14］。称取各供试药剂，加无菌水，配成浓度分别为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0mg／mL的母液。PDA 培养基（每三角瓶49mL）冷却到50℃左右时，分别加入1mL上述浓度的母液，使含药培养基的最终含药浓度分别达到50，100，200，400，800 μg／mL，充分摇匀后，均匀倒入3个培养皿中制成平板。再用打孔器切取直径为6mm的深绿木霉T2菌块，移植于含药平板中央，每处理重复3次。将各处理置于25℃恒温培养箱内培养60h，测量菌落直径。以加入等量无菌水制成的PDA平板为对照。用如下公式计算抑菌率：

以药剂有效成分浓度对数值为自变量（x），相对抑制率的机率值为因变量（y），计算出毒力回归方程式和相关系数。由毒力回归方程，令y＝5（即抑制50%的机率值），反常用对数x即为EC50值。

1.3.2 紫外光诱导 在深绿木霉T2菌株培养物上用直径6mm的打孔器打孔，将菌饼接到PDA平板培养基上，在25℃下恒温培养7d，加无菌水用无菌毛笔轻轻洗刷，用无菌纱布过滤除去菌丝得孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子浓度，使其达到1×108个孢子／mL。将此悬浮液0.1mL，均匀涂布于PDA平板上［10］，置于超净工作台上10W紫外灯管下60cm处（不加盖），用黑布遮住超净工作台，避开外界光进行照射。设0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0h共6个照射时间处理。处理后立即用黑纸把平板包好，并放入25℃的恒温箱中黑暗培养［15］，5d后统计平板上生长菌落数。以不经过紫外光照射的PDA平板为对照。

1.3.3 药剂驯化 将以上培养5d后在PDA平板上生长的菌落打孔，取直径6mm菌饼转移到含速克灵浓度为50μg／mL的含药平板上培养。5d后选取生长最快菌落，在边缘打孔，取直径6mm菌饼接种在速克灵浓度为100μg／mL的含药平板上，在25℃恒温培养。5d后再次选择生长最快的菌落，取直径6mm的菌饼接种在速克灵浓度为200μg／mL的PDA平板上［16］。用此方法，将在速克灵浓度400和800μg／mL上测试，最终选择出生长最快的菌落。

1.3.4 抗药稳定性测定 将筛选出的抗药性木霉菌株分别接种在PDA平板上，于25℃恒温培养，每7d转接1次，连续转接10次［17］。再在速克灵浓度为800μg／mL的PDA平板上培养，测量60h时菌落直径，以原始菌株为对照，计算速克灵对选出菌株的生长抑制率。每处理重复3次。

1.3.5 生长速率及产孢能力测定 将各抗药性木霉菌株取直径6mm的菌块接种于PDA平板上，在25℃下恒温培养，每天测量菌落直径1次，连续测量3d，计算各抗药性木霉菌株的生长速率；培养7d后取10mL无菌水冲洗培养物表面，得到孢子悬浮液。取该悬浮液1mL加入盛有99mL无菌水的三角瓶中，在转速为200r／min的摇床上振荡20min，使孢子在无菌水中分散均匀，用血球计数板测产孢浓度［17］。以上每处理均为3次重复。

1.3.6 对灰葡萄孢菌的拮抗作用测定 将木霉亲本菌株和各抗药性菌株分别与灰葡萄孢菌对峙接种于PDA平板，菌块直径6mm，两接菌点相距40mm。同时，单独接种木霉菌灰葡萄孢菌做对照。每处理重复3次，于25℃下培养，并测量对照灰葡萄孢菌直径和灰葡萄孢菌菌落中心到木霉菌菌落边缘的距离，计算各木霉菌株对灰葡萄孢菌的抑菌率，统计拮抗系数，并筛选出拮抗性最强的菌株。

计算抑菌率采用以下公式：I＝100－（R2／R1）×100%［18］。式中，I为木霉菌的抑菌率，R1为对照灰葡萄孢菌直径，R2为灰葡萄孢菌菌落中心到木霉菌菌落边缘的距离。

拮抗系数分级标准（5级）［19］：Ⅰ级：深绿木霉菌丝面积≥100%平皿面积；Ⅱ级：深绿木霉菌丝面积≥67%平皿面积；Ⅲ级：33%平皿面积＜深绿木霉菌丝面积＜67%平皿面积；Ⅳ级：深绿木霉菌丝面积≤33%平皿面积；Ⅴ级：病原菌菌丝面积≥100%平皿面积。

2 结果与分析

2.1 耐药性测定

深绿木霉T2菌株在含不同杀菌剂的培养基上生长情况详见表1。深绿木霉T2菌株对不同杀菌剂耐药性不同，杀菌剂对木霉菌的抑制作用随药剂施用浓度的增大而逐渐增强。接种培养60h后发现，深绿木霉T2菌株对百菌清、多菌灵、三唑酮、代森锰锌、速克灵和扑海因的耐药性顺序由强到弱分别是代森锰锌、三唑酮、百菌清、多菌灵、扑海因、速克灵，EC50分别为221.14，171.12，150.90，123.24，42.12和26.24μg／mL。

2.2 紫外光诱变选育

紫外光处理对木霉分生孢子有一定的致死作用，但不同照射时间均能有一定数量的孢子存活。其中照射0.5 h平板上产生的菌落数最多，共产生5个；照射3.0h平板上产生的菌落数最少，共产生2个；照射1.0和1.5h平板上产生的菌落数均为4个；照射2.0和2.5h平板上产生的菌落数均为3个。

表1 深绿木霉T2菌株对6种杀菌剂的耐药性测定Table 1 Endurance of T.aureoviride T2against 6kinds of fungicides

2.3 药剂驯化培养

将上述紫外光诱导得到6株突变型菌株，分别标记为T2－1～T2－6。根据测量的各菌落直径，计算生长抑制率。结果表明，亲本菌株T2在含速克灵的培养基上基本不生长，其受抑制率为91.58%，而6个突变型菌株分别为20.75%，24.83%，15.76%和12.41%。其中T2－6受速克灵的影响很小。速克灵对其他突变型菌株 T2－3、T2－4的抑制率较高，分别达到62.34%和70.18%。因此筛选出4株对速克灵抗性较好的突变型菌株T2－1、T2－2、T2－5和 T2－6。

2.4 抗药稳定性

将上述筛选出的抗药性木霉菌株T2－1、T2－2、T2－5和T2－6连续10次转接后发现，速克灵对各抗药性木霉菌株生长抑制率的变化都不是很大，表明突变菌株的抗药性没有随着传代培养而消失。其中T2－6菌株的抗药特性更加稳定，基本未发生变化（表2）。

表2 速克灵对转接后各抗药性木霉菌株的生长抑制率测定Table 2 Growth inhibition rate of Procymidone on each antagonistic Trichodermastrains after inoculation %

2.5 生长速率和产孢能力

从菌丝的生长速率来看，T2－6菌株的平均生长速率最快，明显高于亲本菌株T2和其他3个抗药菌株，T2－5菌株与亲本菌株接近，T2－1和T2－2菌株均低于亲本菌株；在产孢量上，T2－6菌株的产孢量同样明显高于亲本菌株T2和其他3个抗性菌株，亲本菌株的产孢量高于其他3个抗药菌株（表3）。

表3 抗药性木霉菌株的生长速率和产孢能力Table 3 Growth rate and ability of producing spores of antagonistic Trichodermastrains

2.6 抗性木霉菌株对灰葡萄孢菌的拮抗作用

各抗性菌株和亲本菌株对灰葡萄孢菌都有强烈的拮抗作用。各个木霉菌株和灰葡萄孢菌先在平板两边各自生长，48h后两菌落边缘接触，木霉菌对灰葡萄孢菌产生抑制作用，使其生长速率减缓直至停止。抗性菌株T2－6对灰葡萄孢菌的抑制率最高，达到93.26%，T2－5菌株和亲本菌株抑制率相近，仅相差1.31%，T2－2菌株对灰葡萄孢菌的抑制率最低，为82.75%（图1）。T2－1、T2－2菌株对灰葡萄孢菌的平菌抑菌率与亲本菌株的抑菌率差异显著，T2－5和T2－6菌株对灰葡萄孢菌的抑菌率差异不显著，T2－1、T2－2和T2－5菌株对灰葡萄孢菌的抑菌率差异不显著，T2－6菌株与T2－1、T2－2菌株对灰葡萄孢菌的抑菌率差异显著。抗性菌株T2－5、T2－6和亲本菌株的拮抗系数均为Ⅱ，T2－1和T2－2菌株的拮抗系数为Ⅳ。通过对以上试验结果的综合分析，最后筛选出突变型木霉菌株T2－6为最佳抗药性菌株（表4）。

3 讨论与结论

6种杀菌剂对深绿木霉的生长均有一定的抑制作用，且随着药剂浓度的增加，抑制作用越明显；不同的药剂对木霉的抑制力不同，其中代森锰锌的抑制力最低，速克灵的抑制力最高；通过对深绿木霉T2菌株的紫外线诱变处理和含药平板驯化培养，成功筛选出了对速克灵产生高度抗性的突变型菌株。紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简单等优点，是诱导微生物突变的一种非常有用的工具，通过扩大突变体的筛选基数，可得到性能优良的变异菌株［20］。Papvizas［21，22］以苯菌灵为敏感性标记物，采用紫外线诱变对哈茨木霉（T.harzianum）和绿色木霉（T.viride）进行诱变，得到了对苯菌灵有耐药性的菌株，这些变异菌株的生长特性，产孢量以及抗菌能力同亲本菌株相比都有显著改善。杨合同等［10］通过紫外线诱变处理，获得了对多菌灵具有抗性的突变菌株，该突变株在PDA培养基上连续转接培养20代后，其抗药性、生长速度都没有改变，表现非常稳定。本试验发现深绿木霉菌株T2－6，该突变型菌株的生长速率、产孢量以及拮抗作用与亲本菌株相近，而抗药性却远远高于亲本菌株，连续转接10代，其抗药性随传代仍然表现稳定。

木霉菌适应环境的一个重要方面就是对化学农药的抗性，解决了这个问题，才能保证木霉菌在生防中发挥更好的作用，能够最大限度地发挥生物农药的作用，减少化学农药的使用，提高木霉菌制剂对作物病害的防治效果［23，24］。

由于木霉菌在PDA平板的培养是无性繁殖，这种由微效多基因控制的抗性似能稳定遗传［18］，这在本试验中也得到了证明。但是木霉菌在自然条件下存在准性生殖，其抗药性是否能够稳定遗传，还需进一步证明。同时生防制剂的应用还受到温度、湿度、光照等各种因素的影响，获得的抗性菌株与速克灵如何混合、混合使用后的田间防治效果等问题本试验尚未涉及，还有待进一步的研究。

表4 抗药性木霉菌株对灰葡萄孢菌的拮抗作用Table 4 Antagonism of antagonistic Trichoderma strains to Botrytis cinerea

图1 抗药性木霉菌株对灰葡萄孢菌的拮抗作用Fig.1 Antagonism of antagonistic Trichoderma strains to Botrytis cinerea

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