3种制法的四逆汤抗大鼠急性缺血性心肌梗死的药效比较*

尹翠翠 蔺建军，2 杨 勇△ 容 蓉 王晓莉

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东医药技师学院，山东 泰安 271000）

3种制法的四逆汤抗大鼠急性缺血性心肌梗死的药效比较*

尹翠翠1蔺建军1，2杨 勇1△容 蓉1王晓莉1

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东医药技师学院，山东 泰安 271000）

目的 比较3种制法的四逆汤抗大鼠急性缺血性心肌梗死模型的药效，确定较佳的制剂方案。方法将Wistar大鼠随机心肌缺血组、假手术组、传统四逆汤组、药典四逆汤组、单药混合四逆汤组。各给药组均预先给大鼠灌胃4 d（2 g/mL），第4日给药30 min后进行急性缺血性心肌梗死手术，6 h后处死动物取血，检测各组血浆CK活性、MDA和SOD含量；用TTC染色测定各组心脏梗死面积。结果 与假手术组比较，心肌缺血组血浆CK、MDA含量明显升高；与心肌缺血组比较，传统四逆汤组、药典四逆汤组均能明显降低CK含量；与假手术组比较，心肌缺血组SOD有降低趋势，药典四逆汤组、单药混合四逆汤组有升高SOD趋势；与心肌缺血组比较，药典四逆汤组、单药混合四逆汤组有降低MDA含量的趋势。与假手术组比较，心肌缺血组大鼠心脏梗死率明显增大；与心肌缺血组比较，药典四逆汤组、单药混合四逆汤组心脏梗死率均显著缩小。结论 综合分析后认为药典四逆汤组、单药混合四逆汤是治疗大鼠急性缺血性心肌梗死的较佳方案。

四逆汤 急性心肌梗死 制备方法 药效学比较

△通信作者

Comparison Study of Pharmacodynamics that Three Different Extraction Methods of Sini Decoction on

四逆汤由附子、干姜、炙甘草组成，具有回阳救逆之功效，现代研究主要以此3味药的主要有效成分含量为质控依据，筛选和优化四逆汤的最佳提取方案［1-3］。但由于中药化学成分复杂，药物间的配伍关系及相互作用极为关键，因此不能仅从有效成分含量上反映四逆汤的药效作用强弱。为了更加真实准确地反映四逆汤对心肌的防治作用，本课题以急性缺血性心肌梗死大鼠为研究对象，通过比较3种制法的四逆汤抗大鼠急性缺血性心肌梗死模型的药效，确定治疗大鼠急性缺血性心肌梗死的较佳方案。

1 材 料

1.1 实验动物Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，50只，体质量250～300 g，由山东鲁抗动物实验中心提供，动物可证编号：SCXK（鲁）20080002。饲养环境：室温22～26℃，相对湿度40%～70%RH。

1.2 实验仪器BL-420E生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；紫外分光光度计，型号：UV2201，日本岛津；半自动生化分析仪，型号：威图Micr300，荷兰威图科学公司；JA5003型电子天平，上海精科天平厂；GL-20A型全自动高速冷冻离心机，湖南离心机厂。

1.3 实验试剂肌酸激酶（CK），批号：110761；21项生化质控品，批号：111711，购自中生北控生物科技股份有限公司；丙二醛（MDA）试剂盒，批号：20111216；总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒，批号：20110827，购自南京建成生物工程研究所；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），批号：20110720，购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.4 实验药材附子，产地四川江油，为毛莨科多年生草本植物乌头Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品。甘草，产地河北，为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎。干姜，产地广西来宾，为姜科多年生草本姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎。以上药材经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定合格。

2 方 法

2.1 四逆汤溶液的制备

2.1.1 传统四逆汤的制备 按照传统临床常用处方（黑附子450 g，干姜300 g，炙甘草450 g）用量及用法，蒸馏水浸泡1 h，加水量分别是8倍和6倍，水煎煮2次，第1次30 min，第2次20 min，合并浓缩至药液浓度为2 g/mL（每1 mL药液相当于2 g生药材）。制备得四逆汤提取液，冷藏备用。

2.1.2 药典四逆汤的制备［4］取药材粗粉（过20目筛）黑附子450 g，炙甘草450 g，加8倍量水加热回流提取2 h，过滤，残渣加6倍量水加热回流提取1 h，过滤，滤液合并。取药材粗粉（过20目筛）干姜300 g，加12倍量水，水蒸气蒸馏提取5 h，挥发油和蒸馏后的水溶液备用，残渣加6倍量水煎煮1 h，过滤，煎液与上述水溶液合并，滤过，再与附子、炙甘草提取液合并，浓缩至600 mL，加无水乙醇1800 mL，静置24 h后，滤过，减压浓缩至适量，用适量水稀释，冷藏24 h，滤过，加入上述挥发油，加水至600 mL，冷藏备用。

2.1.3 单药混合四逆汤的制备［5］（1）黑附子中生物碱的提取：药材粗粉（过20目筛）450 g，精密称定，24倍量pH=1.0酸水提取2次，振荡浸提，每次1.5 h，过滤，合并滤液并浓缩至约225 mL。（2）炙甘草中黄酮类的提取：药材粗粉（过20目筛）450 g，精密称定，加20倍量0.3%氨水-60%乙醇加热回流提取4次，每次2 h，过滤，合并滤液并浓缩至约225 mL。（3）干姜中挥发油的提取：药材粗粉（过20目筛）300 g，精密称定，加14倍量水，浸泡3 h后水蒸气蒸馏提取5 h，挥发油和蒸馏后水溶液备用，残渣加6倍量水煎煮1 h，煎液与上次蒸馏后水溶液合并，浓缩至约150 mL。将各单味药提取液转移合并为600 mL，冷藏备用。

2.2 分组及造模将大鼠分为心肌缺血组、假手术组、传统四逆汤组、药典四逆汤组、单药混合四逆汤组，每组10只。用4%水合氯醛腹腔麻醉后，气管插管，行人工呼吸。左侧第3、4肋间开胸，剪开心包，暴露心肌，并用圆形无创缝合针6/0丝线置于左冠状动脉前降支起始部下2 mm处结扎左冠状前降支动脉，以ECGⅡ导联ST段明显抬高或T波高耸、心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志。假手术组为穿线不结扎。传统四逆汤组、药典四逆汤组、单药混合四逆汤组均预先大鼠灌胃4 d，给药浓度为21.6 g/kg（即21.6 g生药材/kg体质量），第4日给药30 min后，进行急性缺血性心肌梗死手术，结扎大鼠左冠状前降支动脉（方法同上）。

2.3 标本采集与检测各组大鼠造模成功后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，6 h后分别腹主动脉采血，肝素抗凝，置冷冻离心机中，3000 r/min离心10 min，取上清，-20℃保存待用。各造模大鼠取完血后处死，迅速取出心脏，用冰生理盐水洗尽残血，用滤纸吸干称重，置于-20℃冷冻15 min，15 min后将心脏横切成1～2 mm厚薄均匀的薄片，置于pH 7.4的1%TTC磷酸盐缓冲液中，于37℃染色15 min，4%甲醛溶液固定10 min后，分离梗死心肌和正常心肌（梗死心肌呈白色，非梗死心肌呈暗红色），分别称重，计算梗死心肌占全心湿重的百分比（%），即心肌梗死面积。采用半自动生化分析仪测定造模各组血浆CK活性，采用紫外分光光度计检测血浆中SOD、MDA含量。

2.4 统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差（LSD检验）进行组间差异分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 四逆汤3种不同制法对大鼠血浆中CK、SOD、MDA的影响见表1。与假手术组比较，心肌缺血组血浆 CK、MDA 含量明显升高（P＜0.05或 0.01）；与心肌缺血组比较，传统四逆汤组、药典四逆汤组均能明显降低CK含量（P＜0.01）；与假手术组比较，心肌缺血组SOD有降低趋势，药典四逆汤组、单药混合四逆汤组有升高SOD趋势；与心肌缺血组比较，药典四逆汤组、单药混合四逆汤组有降低MDA含量的趋势。

表1 各组大鼠血浆中CK、SOD、MDA水平比较（±s）

表1 各组大鼠血浆中CK、SOD、MDA水平比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与心肌缺血组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n MDA（nmol/mL）假手术组 10 1.61±0.77心肌缺血组 10 2.89±0.71*传统四逆汤组 10 2.34±1.11 CK（U/L） SOD（U/mL）399.77±146.74 174.10±46.54 625.57±140.26**138.42±67.38 399.32±121.72△△ 142.39±29.83药典四逆汤组 10 2.19±0.88 338.25±86.04△△ 155.98±36.26单药混合四逆汤组 10 543.18±50.24 162.28±45.43 1.90±0.64

3.2 四逆汤3种不同制法对大鼠心肌梗死率的影响见表2。梗死率=梗死区面积质量/全心质量×100%。与假手术组比较，心肌缺血组大鼠心脏梗死面积明显增大（P＜0.01），与心肌缺血组比较，药典四逆汤组、单药混合四逆汤组心脏梗死面积均显著缩小（P＜0.01）。

表2 各组大鼠心肌梗死率比较（±s）

表2 各组大鼠心肌梗死率比较（±s）

组 别 n假手术组 10心肌缺血组 10传统四逆汤组 10心肌梗死率（%）4.38±6.52 19.81±10.10**12.94±11.54药典四逆汤组 10 4.92±3.01△△单药混合四逆汤组 10 5.18±5.19△△

4 讨 论

CK是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，是心肌梗死的重要血生化指标。在各类进行性肌营养不良以及多发性肌炎、皮肌炎中CK明显升高，并具有诊断价值。在临床上，CK及其同工酶活性的检测主要用于诊断与监控心肌损伤等疾病。本实验结果显示，与心肌缺血组组比较，3种制法的四逆汤均可降低心肌缺血大鼠血浆中CK含量，其中传统四逆汤组和药典四逆汤组具有显著差异，单药混合四逆汤组虽有降低趋势，但是并无明差异，提示传统四逆汤组和药典四逆汤组在降低CK活性上效果均优于单药混合四逆汤组。SOD具有特殊的生理活性，在生物体内具有清除自由基的首要作用，研究表明SOD对氧化物和过氧化物的毒性防御具有重要作用，通过消除自由基达到保护细胞的作用。MDA是机体通过酶系统与非酶系统能产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸产生脂质过氧化作用形成的脂质过氧化物，通过测定MDA的含量揭示了自由基引发的脂质过氧化在脑缺血、心缺血、缺氧神经细胞损害中的作用。本实验结果显示与心肌缺血组比较，3种制法的四逆汤均可提高SOD含量，同时降低MDA含量，其中单药混合四逆汤组作用效果最为明显。因大鼠体质量及心脏大小有差异，故用梗死率比较梗死程度。在各实验组心肌梗死率比较中，与心肌缺血组比较，3种不同制法的四逆汤均可缩小大鼠急性缺血性心肌梗死率，其中药典四逆汤组和单药混合四逆汤组差异显著，其结果与假手术组差异较小，提示药典四逆汤和单药混合四逆汤组的制备方法均优于传统四逆汤的制备方法。

本实验通过多指标对3种不同制法的四逆汤抗大鼠急性缺血性心肌梗死的药理作用进行了评价，认为四逆汤能够有效清除氧自由基，减少自由基损坏性因子，减轻脂质过氧化反应，减少心肌酶释放，改善缺血心肌灌流，对大鼠心脏具有积极保护作用，其药效作用的强弱与四逆汤的制备方法密切相关。本实验结果提示传统四逆汤在降低急性心肌缺血大鼠血浆中CK活性上效果较好，但是对血浆中SOD、MDA及心肌梗死率影响较小，因此不认为此治疗方法是抗大鼠急性缺血性心肌梗死的较佳方案。药典四逆汤降低急性心肌缺血大鼠血浆中CK活性的效力强于单药混合四逆汤，但是在提高SOD、降低MDA的含量效果上弱于单药混合四逆汤，两者在缩小急性心肌缺血大鼠心肌梗死率上效果相近，与急性心肌缺血组比较均具有显著差异，综合分析后认为药典四逆汤、单药混合四逆汤是治疗大鼠急性缺血性心肌梗死的较佳方案。

［1］李莹，章津铭，傅超美，等.不同方法制备四逆汤中化学成分对比研究［J］.中草药，2012，34（4）：673-677.

［2］凌家俊，周莉玲.四逆汤提取工艺的筛选［J］.广州中医药大学学报，2000，17（4）：167-169.

［3］刘晓，范林乾，蔡皓，等.正交试验优选四逆汤机械煎煮工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（20）：24-27.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：650.

［5］王晓莉，巩丽丽，容蓉，等.3种方法制备的四逆汤中甘草苷、甘草酸含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：71-74.

Anti-acute Ischemic Myocardial Infarction

YIN Cui-cui1，LIN Jian-jun1，2，YANG Yong1，et al. 1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Jinan 250355，China；2 Shandong Medicine Technician College，Shandong，Jinan 271000，China

Objective:To compared the pharmacodynamics that Sini Decoction with three methods of extraction o anti-acute ischemic myocardial infarction and to determine a better solution for the treatment of anti-acute ischemic myocardial infarction.Methods:Wistar rats were divided randomly into the myocardial ischemia group，he sham-operation control group，the traditional Sini Decoction（SND） group，the pharmacopoeias SND group and THE single-agent mixed SND group.The myocardial ischemia rat group were established by ligation of the left anterior descending coronary artery under 2 mm from starting.The sham-operation group rats were threaded but not ligation.The traditional SND group，the pharmacopoeias SND group，and the single-agent mixed SND group ats were all given SND for 4 days by intragastric administration.The acute ischemic myocardial infarction operaion was executed after

SND thirty minutes in the fourth day.These animals were sacrificed after 6 hours and the blood was collected.Then detected the CK activity，the contents of MDA and SOD in blood plasma of every group.TTC stained myocardial infarct size was measured.Results:Comparing with the sham-operation group，he contents of CK，MDA in myocardial ischemia group were significantly increased.Compared with the myocardial ischemia group，the traditional SND group，pharmacopoeias SND group could reduce the contents of CK obviously.Comparing with the sham-operation group，the contents of SOD in myocardial ischemia group had the trend o decrease，and pharmacopoeias SND group，and single-agent mixed SND group had the trend to increase.Compared with the myocardial ischemia group，the contents of MDA in pharmacopoeias SND group，and single-agent mixed SND group had the trend to decrease.Comparing with sham-operation group，myocardial infarct size of the myocardial ischemia group was enlarged remarkably.Compared with the myocardial ischemia group，myocardial nfarct sizes of pharmacopoeias SND group and single-agent mixed SND group were significantly reduced.Conclusion:It is showed that SND can remove effectively oxygen free radicals.It can reduce the free radical damage actor，the lipid peroxidation and the release of myocardial enzymes.Meanwhile，It can improve the perfusion of myocardial ischemia and protect positively to myocardial ischemia of the rat.It is considered that pharmacopoeias SND and single-agent mixed SND are the better solutions for the treatment of acute ischemic myocardial infarction by comprehensive analysis.

Sini Decoction；Acute myocardial infarction；Extraction methods；Pharmacodynamics comparison

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0880-03

山东省高等学校科技计划项目（J10LF20）

2013-03-04）