解毒活血方对AS易损斑块兔模型易损斑块及CAM-1、TNF-α表达的影响*

吴 辉 卿立金△ 吴 伟 李文晞 李 荣 刘 勇 刘煜德 黄衍寿

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）

解毒活血方对AS易损斑块兔模型易损斑块及CAM-1、TNF-α表达的影响*

吴 辉1卿立金1△吴 伟1李文晞1李 荣1刘 勇2刘煜德1黄衍寿1

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）

目的 探讨解毒活血中药对易损斑块病理及炎症因子人细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法 通过球囊损伤主动脉内膜联合高脂饲料建立实验性动脉粥样硬化易损斑块动物模型，造模兔随机分低剂量中药组、高剂量中药组、辛伐他汀组、模型对照组，分别予以低剂量解毒活血方、高剂量解毒活血方、辛伐他汀、生理盐水灌胃；另设正常对照组以生理盐水灌胃，疗程10周。观察主动脉HE染色病理改变、斑块ICAM-1、TNF-α免疫组化及ELISA检测血清ICAM-1、TNF-α表达改变。结果模型对照组呈现易损斑块特点，斑块内ICAM-1、TNF-α免疫组化正常对照组为阴性，模型对照组呈强阳性表达，高剂量中药组表达显著降低；低剂量中药组呈阳性表达，辛伐他汀组TNF-α呈弱阳性表达，高剂量中药组、辛伐他汀组血清ICAM-1、TNF-α水平降低，与模型对照组比较有明显差异。结论 解毒活血方对实验性兔动脉粥样硬化易损斑块的形成具有预防作用，能降低易损斑块内及血清TNF-α、ICAM-1表达，特别是抑制易损斑块底部和肩部的炎症。

解毒活血 易损斑块 ICAM-1 TNF-α

△通信作者

Effect of Jieduhuoxue Decoction on Vulnerable Plaque and CAM-1、TNF-α Expression in Vulnerable

近年来研究认为动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎症性疾病［1］。炎症反应贯穿于动脉粥样硬化斑块形成、发展和破裂的全过程。炎性细胞因子介导的炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起了极其重要的作用。前期的临床研究表明清热解毒、活血化瘀法治疗急性冠脉综合征有较好的疗效，并能拮抗机体炎症反应，推测抗炎可能是其主要作用机制［2］。本实验在建立实验性动脉粥样硬化易损斑块动物模型的基础上，观察解毒活血中药对易损斑块病理、斑块内及血清炎症因子人细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性新西兰白兔50只，体质量2.5～3.0 kg，约2月龄，由广州中医药大学实验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK（粤）2009-0023。

1.2 试剂与仪器兔ICAM-1、TNF-α多克隆免疫组化抗体试剂盒：购自北京博奥森生物有限公司，PBS、柠檬酸抗原修复液：广州外显子生物公司；广谱二抗显色系统：DAKO公司；兔血清ICAM-1、TNF-α ELISA Kit RD进口分装：购自北京索来宝科技有限公司；二甲苯；中性树胶；显微镜；图像分析软件 Motic Images Plus 2.0光学显微镜400X。

1.3 药物解毒活血方由黄连、栀子、黄柏、黄芩、川芎、赤芍、丹参、红花、降香组成，按 1.5∶1.5∶1∶1∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2比例由广州中医药大学第一附属医院药剂科煎制、浓缩成水煎剂，含5 g/mL生药，置冰箱内冻存，使用时以蒸馏水以1∶10比例稀释。辛伐他汀片剂（杭州默沙东制药有限公司，20 mg/片），使用时以蒸馏水配置成悬液给药。

1.4 模型制备10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉动物，固定，经耳缘静脉注射肝素钠200 U/kg。常规消毒皮肤、铺巾。在无菌条件下，沿右股动脉走行方向切开皮肤，分离皮下组织及肌肉，钝性分离右股动脉，结扎股动脉远心端。直视下以Cordis桡动脉穿刺针穿刺股动脉，插入4F桡动脉鞘管，在PTCA导丝导引下插入2.5 mm×20 mm冠脉预扩球囊，使球囊约位于胸主动脉上段，维持压力泵压力6～8个大气压，并缓慢回拉球囊，重复操作3次，损伤胸腹主动脉内膜。术后结扎股动脉近心端，缝合手术切口。伤口处洒8万U庆大霉素防止感染。放回兔笼，自行苏醒。内膜球囊损伤术1周后开始高脂饲料，高脂饲料由普通颗粒饲料+1%胆固醇+5%猪油组成，每日120 g，自由摄水，喂养10周。

1.5 分组与给药内膜球囊损伤术后适应1周，第3周随机分成4组，分别为低剂量中药组、高剂量中药组、辛伐他汀组、模型对照组，每组10只。低剂量中药组、高剂量中药组分别以解毒活血方40、80 g/（kg·d）灌胃；辛伐他汀组以2.6 mg/（kg·d）剂量的辛伐他汀悬液灌胃；模型对照组以生理盐水灌胃，另设普通饲料喂养未行内膜球囊损伤术正常对照组10只，以生理盐水灌胃。各组灌胃每日1次。疗程10周。

1.6 标本采集与检测（1）HE染色观察主动脉病理改变。给药10周处死家兔，取胸主动脉，用10%甲醛固定，常规浸蜡、包埋、切片，HE染色，进行镜下组织学观察。（2）免疫组织化学染色。每组每个标本随机取5张石蜡切片，应用免疫组化SABC法，参照试剂盒说明书操作。阳性着色为内皮表面棕褐色反应产物沉积，呈胞浆染色，以PBS代替一抗作空白对照组。（3）ELISA法测定血清ICAM-1、TNF-α。给药10周经耳缘静脉采取静脉血4 mL，4℃3000 r/min离心15 min，分离血清。采用ELISA法测定血清ICAM-l、TNF-α浓度，按照酶联免疫试剂盒说明进行。

1.7 统计学处理应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 主动脉HE染色结果正常对照组血管组织结构正常，内膜完整。模型对照组局部明显隆起，见大量泡沫细胞，斑块表面形成溃疡，呈现易损斑块特点。低剂量中药组内膜增厚，斑块突出管腔，见中等量状泡沫细胞。高剂量中药组少许斑块突出管腔，少量状泡沫细胞，呈现稳定斑块的病理特征。辛伐他汀组有少许斑块突出管腔，少量空泡状泡沫细胞。见图1。

图1 主动脉HE染色、免疫组织化切片图

2.2 胸主动脉免疫组织化学染色结果正常对照组偶见少量ICAM-1、TNF-α染色较浅的阳性表达细胞。模型对照组ICAM-1、TNF-α呈强阳性表达，且ICAM-1阳性表达以斑块底部和肩部最明显。与模型对照组比较，高剂量中药组ICAM-1、TNF-α表达显著降低；低剂量中药组TNF-α呈阳性表达，但ICAM-1表达与模型对照组比较变化不明显；辛伐他汀组TNF-α呈弱阳性表达，ICAM-1表达与模型对照组比较变化不明显。见图1。

2.3 血清ICAM-1、TNF-α水平ELISA检测结果见表1。血清ICAM-1水平，与正常对照组比较，高剂量中药组差异无统计学意义，余各组ICAM-1水平增高，差异有显著性；与模型对照组比较，高剂量中药组、辛伐他汀组ICAM-1表达水平降低，差异有显著，而低剂量中药组差异无统计学意义；高剂量中药组与辛伐他汀组比较，差异无统计学意义。血清TNF-α水平，与正常对照组比较，高剂量中药组、辛伐他汀组差异无统计学意义，余各组TNF-α水平增高，差异显著；与模型对照组比较，各干预组TNF-α降低，差异显著。

表 1 各组血清 ICAM-1、TNF-α 水平比较（±s）

表 1 各组血清 ICAM-1、TNF-α 水平比较（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05。

组 别 n CRP（mg/L） Fbg（g/L）低剂量中药组 8 19.123±1.742* 2.410±0.361*△高剂量中药组 7 17.029±1.287△ 2.126±0.322△辛伐他汀组 8 17.550±0.971*△ 2.103±0.181△模型对照组 7 21.556±2.065* 3.639±0.744*正常对照组 9 14.100±2.766 1.746±0.352

3 讨 论

TNF-α具有促炎症、促凝血、抗纤溶反应作用，与动脉粥样硬化易损斑块密切相关，TNF-α是斑块不稳定的重要预测因子［3-4］。ICAM-1以血管内皮细胞表达最强，介导细胞与细胞或细胞与基质间相互接触和结合，与炎症细胞的渗出定位密切相关。ICAM-1通过与炎症因子及其他活性物质的相互作用影响粥样斑块稳定性，削弱了斑块处的纤维帽，加快了斑块破裂、血栓的形成，促进 ACS 发生［5-6］。

AS易损斑块破裂导致ACS发生，起病急骤，进展迅速，变化多端，病情危重，与中医“热毒”病机相似。吴伟等［7-8］指出易损斑块乃热毒为患，其性峻烈，变化无常，常演变为各种危候，急性冠脉综合征患者多伴有舌暗红、苔黄腻、口干、口苦、大便秘结等表现，中医病机多是热毒血瘀。解毒活血方由黄连、栀子、黄柏、黄芩、川芎、赤芍、丹参、红花、降香组成，有黄连解毒汤苦寒直折，清热、泻火、解毒之功效；川芎、赤芍、丹参、红花、降香具有活血化瘀，通络止痛之效。全方具有清热解毒，活血化瘀之效。

本研究中病理学观察提示解毒活血方对实验性兔AS易损斑块的形成具有预防作用，表现为与模型对照组相比，动脉粥样斑块呈现出稳定型斑块的特征，这作用呈剂量依赖性，高剂量解毒活血方的作用明显，与辛伐他汀相当。免疫组化检测结果显示：中药干预TNF-α免疫组化阳性细胞减少，颗粒染色减轻，西药辛伐他汀治疗阳性细胞的褐色颗粒染色较浅，数量减少。表明辛伐他汀、不同剂量清热解毒活血中药配伍进行干预治疗，均具有降低兔AS模型主动脉及粥样斑块TNF-α表达的作用，尤其以高剂量中药效果最明显，与给药浓度呈正相关。斑块ICAM-1免疫组化模型对照组呈强阳性表达，且以斑块底部和肩部最明显，表明此处炎症细胞渗出明显；低剂量中药组、辛伐他汀组与模型对照组比较阳性细胞表达差异不明显；高剂量中药组阳性细胞可见，但较模型对照组显著减少。表明辛伐他汀、低剂量清热解毒活血中药配伍进行干预治疗，对降低兔AS模型粥样斑块ICAM-1表达的作用不明显，而高剂量中药组能降低斑块ICAM-1表达，抑制斑块底部和肩部的炎症渗出。高剂量解毒活血方、辛伐他汀都能明显能降低血清TNF-α、ICAM-1水平，提示降低血清炎症因子不一定能降低斑块内炎症因子，稳定易损斑块可能主要抑制斑块内炎症为主。

本实验结果提示清热解毒活血法能降低易损斑块TNF-α、ICAM-l表达，特别是抑制易损斑块底部和肩部的炎症。这也可能是清热解毒活血法稳定动脉粥样硬化易损斑的可能机制之一。

［1］Weissberg PL，Bennetl MR.Atherosclerosis：An inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340（24）：1928-1929.

［2］吴伟，彭锐，李荣，等.清热活血方治疗冠心病急性心肌梗死 60 例临床观察［J］.中医杂志，2010，51（10）：905-908.

［3］Ali CA，Mustafa A，Mehmet T，et al.Levels of serum IL-1β，IL-2，IL-8 and tumor necrosis facor-α in patients with unstable angina pectoris［J］.Mediators Inflamm，2003，12（6）：361-365.

［4］孙芳毅，李星涛，付华，等.急性冠状动脉综合征患者血清肿瘤环死因子-α、白细胞介素-10比率失衡的临床意义［J］.临床荟萃，2005，20（23）：1343-1345.

［5］曾知恒，吴海珊.急性冠脉综合征病人血清sCD40L和血浆 sILAM-1、sE-selectin 关系的研究［J］.广西医学，2004，25（11）：1592-1593.

［6］DeGraba TJ，Siren AL，Penix L，et al.Increased endothelial expression of interce-llular molecule-1 in symptomatic versus asymptomatichumancarotidatheroscleroticplaque［J］.Stroke，1998，29（7）：1405-1410.

［7］吴伟.冠心病支架术后中医药治疗初探［J］.中国中西医结合杂志，2011，31（3）：303-305.

［8］吴伟，彭锐.冠心病热毒病机的探讨［J］.新中医，2007，39（6）：3-4.

Plaque Rabbits′Models

WU Hui，QING Li-jin，WU Wei，et al. The First Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Guangzhou 510405，China

Objective:To investigate the effect of Jieduhuoxue Decoction on vulnerable plaque and CAM-1 and TNF-α expression in vulnerable plaque rabbits′model.Methods:The forty vulnerable plaque models were eastablished by injuring the rabbits′abdominal-thoracic aorta intima with the balloon-injured angioplasty through femoral artery at the second week，then followed with high cholesterol feeding beginning at the third week.These forty model rabbits were randomly divided into four groups such as the model control group，the simvastatin treating group，the small-dose Jieduhuoxue Decoction group，the large-dose Jieduhuoxue Decoction group.At the third week，first of drug interventions were added during the process.And there was a normal control group those were ten healthy male New Zealand white rabbits fed with standard feed.After administered for 10 weeks，the concentrations including ICAM-1 and TNF-α in the serum were examined by ELISA.Some indices were observed and detected including the morphology of the atherosclerotic vas，the expression of ICAM-l and TNF-α in the artery with immunohistochemistry.Results:The vulnerable plaque animal model was successfully established.The aortic plaques of large-dose Jieduhuoxue Decoction group showed characteristics of stable plaque.Immunohistochemistry results found that ICAM-1 and TNF-α plaque was negative in the control group.It showed strong positive expression in model control group which was significantly decreased in the large-dose Jieduhuoxue Decoction group.This index in the small-dose Jieduhuoxue Decoction group was positive.The simvastatin group TNF-α showed weak positive expression.From the ELISA results，the TNF-α levels were reduced in the large-dose Jieduhuoxue Decoction group and the simvastatin group.Meanwhile，the serum ICAM-1 and TNF-α levels were reduced ompared with the model group.Conclusion:Jieduhuoxue Decoction could prevent atherosclerosis vulnerable plaque by lowering the expression of ICAM-1 and TNF-a in vulnerable plaque rabbits'model.The outcome was positively related to the concentrations of Jieduhuoxue Decoction.

Jieduhuoxue；Vulnerable plaque；ICAM-1；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0877-03

广东省科技计划项目（20090315）

2013-03-03）