突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建

陈 挺，张必利，何 平，程 平，郑 兴

家族性心室预激、传导系统病变及心肌肥厚在2002年首次被归结为分子遗传学疾病，并被统称为PRKAG2心脏综合征。这是一种少见的常染色体显性遗传性疾病，主要由于编码腺苷-磷酸激活的蛋白激酶γ2调节亚单位基因的PRKAG2发生错义突变，例如，有人认为该基因R302Q位点突变与预激有关［1-2］。患者会出现阵发性室上性心动过速，需安装永久起搏器，同时有可能伴有心肌肥厚、左室功能障碍等临床表型［3-4］。本研究拟通过构建含有突变位点R302Q的PRKAG2的真核表达载体，为进一步研究基因PRKAG2 R302Q突变的功能以及PRKAG2心脏综合征的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

大肠杆菌感受态细胞Top10，由笔者所在实验室制备;真核表达载体 pIRES2-EGFP(Clontech公司);KOD高保真DNA聚合酶(TOYOBO公司);限制性内切酶Nhe I、BamH I(Fermantas公司);T4DNA连接酶(NEB公司);普通质粒小抽试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和PCR清洁试剂盒(Axygen公司);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录酶(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 设计用于PCR扩增人野生型PRKAG2基因(NCBI基因ID号51422)CDS区的引物，ATG起始位点前增加Kozak序列GCCACC，引物名称及序列:F1，5'-GTCAGCTAGCGCCACCATGGGAAGCGCGGTTATGG-3';R1，5'-TGTAGGATCCTCACTCCGTTTCTGTCTCCTTTTGT-3';设计R302Q定点突变引物，突变位点位于引物中间位置，引物名称及序列:RQ1，5'-GCCAACGGTGTCCGAGCAGCGCCACTGT-3';RQ2，5'-ACAGTGGCGCTGCTCGGACACCGTTGGC-3'，以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 人野生型基因 PRKAG2的克隆 用 Trizol法抽提健康人全血mRNA，逆转录合成cDNA第1条链，采用F1/R1特异引物PCR扩增目标序列，PCR 体系:cDNA 0.5 μl，F1 引物 0.5 μl，R1 引物0.5 μl，KOD DNA 聚合酶 0.5 μl，浓度 2 mmol/L 的dNTP 2 μl，浓度 25 mmol/L 的 MgSO41 μl，10 × KOD Buffer 2.5 μl，无菌双蒸水加至 25 μl。反应体系在冰上配制，混匀，瞬时离心后置于PCR仪，95℃预变性 5 min 后;95℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，进行35个循环;最后68℃延伸5 min。目标片段回收，经Nhe I、BamH I双酶切连接至pIRES2-EGFP载体中，筛选阳性克隆测序验证。

1.2.3 人突变型基因 PRKAG2 R302Q的克隆(1)PCR分段扩增引入突变序列。以人野生型PRKAG2基因为模板，分别采用F1/RQ2、RQ1/R2 2对引物进行PCR扩增，扩增产物分别命名为RSa、RSb。扩增结束后将PCR扩增产物全部上样，用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割目的片段，胶回收试剂盒纯化。PCR体系及反应条件:模板pPRKAG2-IRES2-EGFP质粒 0.1 μl，F1/RQ1 0.5 μl，RQ22/R1 0.5 μl，KOD DNA 聚合酶 0.5 μl，浓度 2 mmol/L 的 dNTP 2 μl，浓度 25 mmol/L 的 MgSO41 μl，10 × KOD Buffer 2.5 μl，无菌双蒸水加至25 μl。反应体系在冰上配制，混匀，瞬时离心后置于PCR仪，95℃预变性5 min后;95℃变性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸60 s，进行30 个循环;最后68℃延伸5 min。(2)PCR拼接获得PRKAG2 R302Q全长。将上述纯化得到的2个分段PCR产物RSa、RSb作为模板，采用F1/R1引物PCR扩增，得到PRKAG2 R302Q基因片段，PCR扩增产物全部上样，用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割目的片段，胶回收试剂盒纯化。PCR体系及反应条件:模板RSa 0.5 μl，模板 RSb 0.5 μl，F1 0.5 μl，R1 0.5 μl，KOD DNA 聚合酶1 μl，浓度 2 mmol/L 的 dNTP 4 μl，浓度25 mmol/L 的 MgSO42 μl，10 × KOD Buffer 5 μl，无菌双蒸水加至50 μl。反应体系在冰上配制，混匀，瞬时离心后置于PCR仪，95℃预变性5 min后;95℃变性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸2 min，进行30 个循环;最后68℃延伸5 min。

1.2.4 重组载体 pR302Q-IRES2-EGFP的构建(1)酶切、连接、转化。用Nhe I、BamH I双酶切回收产物R302Q片段和pIRES2-EGFP载体，37℃水浴酶切2 h。酶切体系:10 × TangoTMBuffer 5 μl，Nhe I 2 μl，BamH I 2 μl，R302Q/pIRES2-EGFP 25 μl，无菌双蒸水加至50 μl。PCR清洁试剂盒回收酶切基因及载体产物，T4DNA连接酶4℃连接过夜，得到的质粒为pR302Q-IRES2-EGFP。将重组质粒42℃热击转化Top10感受态细胞，37℃培养箱中培养过夜。(2)阳性克隆鉴定。挑取转化板的单克隆，置于20 μl无菌水中溶解，取1 μl菌液作模板，特异引物F1/R1进行PCR扩增，取5 μl扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。反应体系:10×Taq Buffer 2 μl，F1 0.3 μl，R1 0.3 μl，菌液 0.5 μl，Taq 0.3 μl，浓度 2 mmol/L 的 dNTP 2 μl，无菌双蒸水加至 20 μl。反应体系在冰上配制，混匀，瞬时离心后置于PCR仪，94℃预变性5 min后;94℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸2 min，进行30个循环;最后72℃延伸10 min。挑取PCR鉴定正确的阳性克隆进一步采用Nhe I、BamH I双酶切验证后，挑取2个克隆送Invitrogen公司采用通用引物测序。Axygen质粒小抽试剂盒抽提测序正确的克隆质粒。

2 结果

2.1 人野生型PRKAG2基因的克隆

Trizol法提取人细胞mRNA，经RT-PCR合成cDNA第1条链，特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段，目的片段条带在1710 bp左右，酶切连接至pIRES2-EGFP载体中测序验证，与NCBI公布序列完全一致，表明正确扩增出PRKAG2基因片段见图1。

图1 人野生型PRKAG2的RT-PCR电泳图

2.2 人突变型基因PRKAG2R302Q的克隆

以人野生型基因PRKAG2为模板，通过PCR拼接的方法，分段扩增得到PRKAG2R302Q基因2段，大小分别为900 bp与800 bp左右，均与预期一致。见图2。胶回收纯化克隆得到的基因片段，再分别以以上2个片段为模板，通过PCR拼接得到了约1700 bp的目标片段，与预期一致。见图3。

图2 PRKAG2的RSa、RSb片段扩增结果

2.3 重组载体pR302Q-IRES2-EGFP的构建

以Nhe I、BamH I分别双酶切 pIRES2-EGFP和上述胶回收片段，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割阳性片段，胶回收试剂盒回收酶切片段。经T4DNA连接酶连接双酶切产物，构建pR302Q-IRES2-EGFP重组载体。转化Top10感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆。见图4。筛选得到的阳性克隆进一步采用酶切验证。见图5。挑取2个阳性克隆送Invitrogen公司测序，结果与设计完全一致。

图3 PRKAG2 R302Q的RSa、RSb片段拼接电泳图

图4 pR302Q-IRES2-EGFP重组载体菌落PCR鉴定结果

图5 pR302Q-IRES2-EGFP重组载体酶切鉴定结果

3 讨论

PRKAG2是AMPK γ2调节亚基的编码基因，在心肌和骨骼肌高度表达［5］。AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，由α、β、γ亚基组成异质三联体，在细胞中作为代谢感受器，监测细胞内AMP/ATP比值，通过调节ATP的消耗和产生，在心肌代谢过程中发挥关键作用。在低氧、缺血、肌肉运动等应激情况下，细胞内AMP/ATP的比值升高，AMP与AMPK的γ亚基结合，使α亚基的苏氨酸暴露，通过上游激酶-AMP激活蛋白激酶激酶(AMP-activated protein kinase kinase，AMPKK)使苏氨酸磷酸化，AMPK 被激活［6］。AMPK激活后通过减少维持生命并非必要的ATP消耗，以及通过促进细胞内葡萄糖的摄取和加强氧化分解代谢刺激ATP的产生，调节体内代谢平衡［7］。

关于PRKAG2突变对AMPK功能的影响，在细胞水平的研究发现，转染突变型PPKAG2基因的人CCL13 细胞株的 AMPK 活性降低［8］;而 Arad 等［9］的研究表明，AMPK基础活性反而增高。Hamilton［10］和Barnes［11］等的研究结果与Arad的研究结果一致，并且发现AMPK对AMP的敏感性降低。Burwinkel等［12］认为，由于不同实验所用的细胞株不一样，因此研究结果不同。CCL13细胞株中的肿瘤抑制蛋白LKB1是AMPK的主要上游底物，含量与其他细胞有显著差异，而突变的AMPK结构基因只有在足量LKB1存在的条件下才能增加AMPK的基础活性，并降低AMPK对AMP的敏感性。

研究表明，PRKAG2心脏综合征患者均有PRKAG2基因突变。所以，对该基因突变进行研究，进而阐述其发病机制尤为重要。为阐明这种缺陷机制，Sidhu等制备了表达人类突变PRKAG2基因的转基因小鼠［13］，转基因小鼠出现的变化表型与人的家系性预激患者相似。

本研究克隆了突变型人PRKAG2 R302Q基因并构建了其真核表达载体pR302QvIRES-EGFP，后续可通过转染心肌细胞进行相关检测，为进一步研究PRKAG2 R302Q突变功能奠定了基础。

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