马钱子总生物碱树脂复合物的制备及结合机制

李伟男，于 鑫，王莹莹，曹 欢，张智慧，李 洋，王艳宏

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨150040)

离子交换树脂是一种在交联聚合物中含有离子交换基团的功能高分子材料，20世纪50年代开始逐渐应用于药物传递系统的研究与开发，作为药物载体具有多种优良特性，包括掩味、缓释、稳定等作用，在药剂学中得到广泛应用[1].药物树脂传递给药系统是指带正负电荷的离子型药物与阴阳离子交换树脂结合制成药物树脂复合物，能达到掩盖药物不良嗅味，增加了药物的稳定性，减少药物对胃肠道的刺激，改善药物在体内药动学性质等目的[2－3]，因此药物树脂是一种非常理想的药物载体.

马钱子为马钱科常绿乔木植物马钱Strychnos nux—vomica L.的成熟种子，冬季采收成熟果实，取出种子，晒干，又名番木鳖.根据《中国药典》2010 版[4]，其苦，温;有大毒.归肝、脾经.具有通络止痛，散结消肿.用于跌打损伤，骨折肿痛，麻木瘫痪，痈疽疮毒，咽喉肿痛.马钱子的主要有效部位为总生物碱，士的宁(strychnine)和马钱子碱(brucine)是总生物碱中最主要的2种生物碱成分.马钱子的传统制剂主要为马钱子散、马钱子丸等，存在安全性及顺应性差等问题.马钱子的治疗量为0.3 ～0.6 g，其主要中毒物质是士的宁，口服中毒剂量成人为 5 ～10 mg，口服致死量为 30 mg[5]，因此为了保证安全用药，将其与阳离子交换树脂结合，制成缓释制剂，使其缓慢释放，而且还可以掩盖其苦味.本文是以士的宁(strychnine)和马钱子碱(brucine)为指标成分，研究马钱子总生物碱与离子交换树脂交换后制备树脂复合物的可能性，为中药有效部位的树脂复合物的制备提供一定研究基础.

1 仪器和试剂

乙醇，哈尔滨市新达化工厂;氢氧化钠，天津市东丽区天大化学试剂厂;盐酸，哈尔滨市新达化工厂;氨水，天津市凯通化学试剂有限公司;AB－8型大孔吸附树脂，南开大学化工厂;去离子水(以上均为分析纯).娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)，色谱甲醇(Amethysr Chemicals)士的宁、马钱子碱对照品，中国食品药品检定研究院;

Waters2695－2996高效液相色谱仪，含有在线脱气、高压四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)，Empower色谱工作站;电子调温型电热套，98－I－B型，天津市泰斯特仪器有限公司;DELTA320pH计，梅特勒－托利多仪器上海有限公司;旋转蒸发器，R－205型，上海申胜生物技术有限公司;FA2004分析电子天平，上海良单仪器仪表有限公司;真空干燥箱DZF6090，上海恒科技术有限公司;WCT－1D微机差热天平，北京光学仪器厂.

2 方法与结果

2.1 总生物碱质量浓度的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇∶水∶乙酸∶三乙胺(76∶230∶2.4∶0.3);流速 1.0 mL/min;检测波长 254 nm;柱温30℃.

2.1.2 标准曲线的绘制

精密称取士的宁对照品6 mg，马钱子碱对照品5 mg定容至同一25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度.分别精密移取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀.精密吸取10 μL，注入液相色谱仪.以峰面积(A)为纵坐标，对照品质量浓度(C)为横坐标作图，得标准曲线.回归方程为士的宁回归方程为A= －71 053+22 861 C，r=0.999 8;马钱子碱回归方程为A= －77 682+12 307 C，r=0.999 7.

结果表明，士的宁质量浓度在24～120 μg/mL马钱子碱质量浓度在20～100 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系.

2.2 马钱子总生物碱的提取和纯化

2.2.1 马钱子总生物碱的提取

取马钱子粗粉200 g，加6倍量pH值为5的50%乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤，回收乙醇，用盐酸调pH值至2～3，过滤，滤液用氨水调至pH值9～10，水浴蒸干，备用.

2.2.2 AB－8型大孔吸附树脂纯化马钱子总生物碱

AB－8大孔树脂的预处理:AB－8大孔吸附树脂，95%乙醇浸泡24 h，装柱，用95%乙醇洗柱至醇∶水=3∶1无浑浊，蒸馏水洗至中性，用5%的盐酸洗柱，洗20倍的柱体积，蒸馏水洗至中性，再用5%的氢氧化钠溶液洗柱，洗20倍的柱体积，用蒸馏水洗至中性.

上样:将一定质量浓度的马钱子样品液缓慢加入装有AB－8树脂的玻璃柱中，静置12 h，使药物与树脂充分结合.

洗脱:流速为1.0 mL/min，用蒸馏水3BV洗至无色，30%乙醇0.5倍体积洗脱，除去糖类和皂苷类，用70%的乙醇4倍体积洗脱，收集流出液，并回收乙醇，流出液浓缩，干燥，即得马钱子总生物碱干膏重备用.经HPLC测得士的宁占总生物碱的36.16%，马钱子碱占总生物碱的22.98%.

2.3 药物－树脂复合物的制备

2.3.1 离子交换树脂的预处理

取适量的强酸性阳离子交换树脂将其粉碎过筛，选取不同粒径范围.将上述树脂分别用50℃左右的热水反复冲洗，直至将杂质洗净，用95%乙醇浸泡4 h并不断的搅拌，除去吸附的少量有机物质，并水洗至无醇残留.经上述处理后的树脂分别用10倍体积的1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L Na0H溶液浸泡4 h，并不断的搅拌，弃去HCl和NaOH溶液，最后用去离子水冲洗树脂至中性，烘干备用.本实验最终分别转型为Na+和H+型两种类型树脂备用.

2.3.2 药物－树脂静态制备方法的考察

精密称取已预处理好的阳离子交换树脂适量[6]，加入到一定质量浓度的马钱子总生物碱药物溶液中，在不同温度下以一定转速的下进行充分的充分搅拌，并于设定的时间取样，用HPLC法测定士的宁和马钱子碱的峰面积，分别按式(l)、(2)计算树脂的交换药量(Q)及药物利用率(E)，至药物质量浓度基本不变时，反应即达平衡[7].

其中:Q为t时刻单位质量树脂的交换药量，g/g;ρ0为士的宁或马钱子碱的初始质量质量浓度，g/L;ρt为t时刻士的宁或马钱子碱的质量浓度，g/L;V为士的宁或马钱子碱的溶液体积，mL;mR为干态树脂质量，mg.

1)不同离子类型的离子交换树脂对静态交换反应的影响

分别取已处理好的H+型阳离子交换树脂和Na+型阳离子交换树脂各100 mg加入到25 mL质量浓度为2 mg/mL的马钱子总生物碱溶液中，在50℃的恒温水浴下进行搅拌，直至交换平衡，分别在10、20、40、60、90、120、180 min 取样，用 HLPC 法测定溶液中剩余的药量，计算树脂交换药量，并以交换量(Q)对交换时间(t)作图得马钱子碱和士的宁的静态交换动力学曲线图.见图1、2.

两种类型的阳离子交换树脂对士的宁和马钱子碱的平衡交换量没有影响，但是Na+型阳离子交换树脂比H+型阳离子交换树脂对总生物碱交换速率小.

2)离子交换树脂不同粒径对静态交换反应的影响

分别取80～100目、120～140目和160～180目的不同粒径的阳离子交换树脂各100 mg加入到25 mL质量浓度2 mg/mL的马钱子总生物碱溶液中，在50℃恒温水浴下搅拌，直至交换平衡，分别在10、20、40、60、90、120、180 min 取样，用 HLPC 法测定溶液中剩余的药量，计算树脂交换药量，并以交换量对交换时间作图得静态交换动力学曲线.见图3、4.

士的宁和马钱子碱与离子交换树脂的交换速率随粒径的减小而增大，反应平衡时间缩短，但平衡交换量基本不变.

3)不同浓度盐酸溶液对静态交换反应的影响

取100 mg H+型阳离子交换树脂2份，分别加入到25 mL质量浓度为2 mg/mL的0.1和0.01 mol/L HCl溶解的马钱子总生物碱溶液中，在50℃恒温水浴下搅拌，直至交换平衡，分别在10、20、40、60、90、120、150 min 取样，用 HLPC 法测定溶液中剩余的药量，，计算树脂交换药量，并以交换量对交换时间作图得马钱子碱和士的宁的静态交换动力学曲线.见图5、6.

图5 不同离子浓度对士的宁与树脂反应的影响

图6 不同离子浓度对马钱子碱与树脂反应的影响

两种不同浓度盐酸溶液对士的宁和马钱子碱与离子交换树脂的平衡交换量没有影响，但0.01 mol/L HCl溶液溶解总生物碱士的宁与马钱子碱与树脂反应的速率较快.

4)起始药物质量浓度对静态交换反应的影响

取阳离子交换树脂100 mg分别加入到25 mL质量浓度为1、2、4 mg/mL的马钱子总生物碱溶液中，于50℃恒温水浴下搅拌至交换平衡直至交换平衡，取样，用HLPC法测定溶液中剩余的药量，计算树脂交换药量(Q)及药物利用率(E)，并以交换量及药物利用率对起始药物质量浓度作图.见图7、8.

当树脂与药物的交换未达到饱和交换量时，随着药物质量浓度的增加，树脂平衡交换量升高.但当药物质量浓度增加到某一值时，即药物达到饱和交换量时，树脂平衡交换量增加幅度小.随着起始药物质量浓度升高，士的宁和马钱子碱的利用率降低.

5)温度对静态交换反应的影响

取阳离子交换树脂100 mg加入到25 mL质量浓度2 mg/mL的马钱子总生物碱溶液中，分别在20、40、50℃恒温水浴下搅拌，直至交换平衡，并分别在10、20、40、60、90、150、180 min 取样，用 HLPC法测定溶液中剩余的药量，计算树脂交换药量，并以交换量对交换时间作图得静态交换动力学曲线.见图9、10.

温度对士的宁和马钱子碱的药物－树脂制备反应速率有影响，随着温度的升高，士的宁和马钱子碱与树脂的交换速率加快，交换反应平衡时间明显缩短，但对载药量无影响.但是由于温度过高会使马钱子总生物碱分解变质，因此该制备温度在马钱子总生物碱和离子交换树脂可耐受的范围内.

2.4 药物－树脂结合机制的探讨

采用示差扫描分析法对马钱子总生物碱、阳离子交换树脂、马钱子总生物碱和阳离子交换树脂的混合物(质量比1∶1)、马钱子总生物碱药物－树脂复合物的经行扫描.

测定条件:扫描温度为30～400℃，升温速度为10℃/min，参比物为空白干锅，气氛为空气，样品质量15 mg.

离子交换树脂具有一定特征的熔融吸热风，当其吸收药物后，其吸热峰会发生变化如图11～14所示.马钱子总生物碱中士的宁的熔点为200℃，马钱子碱的熔点为284～286℃，实验中为出现马钱子碱的吸热峰，可能是被其他生物碱吸热峰覆盖;阳离子交换树脂的吸热峰在100℃;总生物碱与树脂的简单混合物的吸热峰只是吸热峰的叠加，而药物－树脂复合物则出现新的吸热峰，说明马钱子总生物碱与药物的结合非简单的物理性吸附，而是通过化学作用既离子键结合.

3 讨论

离子交换树脂是一种具有网状的立体结果，能过与溶液中的离子小分子如 H+、Na+、Mg2+、Cl－等小分子结合，也可以和较大的有机离子如离子型的药物、高分子聚合物结合.根据其原理，离子交换树脂可以与带有电荷的药物结合形成不溶性的聚合物即:

式中，A－NH2和B－COOH分别代表碱性和酸性药物，R－SO3H和R－NH3OH分别代表阴离子型和阳离子型树脂.大多数生物碱可以与酸形成盐[8]，且能解离成带正电荷的离子型药物，能够与离子交换树脂反应.

对于静态交换法制备药物树脂复合物而言，制备工艺的选择应考虑反应药物利用率、载药量和反应速率3个因素的影响.最佳工艺应为药物利用率最高、载药量高和反应速率快[9]的工艺，因此本文考查了离子交换脂的类型、离子交换树脂的粒径、H+的浓度、反应温度和药物起始质量浓度对静态交换反应中药物利用率、载药量和反应速率的影响[10].

结果表明:H+型树脂在反应的速率上快于Na+型的树脂，这可能是H+的原子半径比Na+的小，是其在树脂内部及溶液中扩散的速率较大，与士的宁和马钱子碱更早的达到交换平衡，但是交换量没有明显变化.树脂的粒径大小、反应温度对药物的利用率和载药量没有明显的变化，但是树脂粒径越小，表面积越大，与溶液中药物离子接触的面积越大，温度越高离子在树脂内部和溶液中扩散Na+的速度越快，所以树脂粒径越小、温度越高反应速率越快，达到平衡时间越短.士的宁和马钱子碱与树脂的交换量药物起始质量浓度的影响，药物－树脂复合物的制备过程质量浓度应选用饱和溶液和交换量的最低药物质量浓度作为实际操作条件，以达到较高的载药量和药物利用率.

本实验采用盐酸溶液作为反应溶剂.H+作为溶液中惟一可置换药物的反离子，其离子浓度越高，其与药物的交换量越多，与离子交换树脂竞争药物离子，导致平衡时交换下来的药物越多.但士的宁和马钱子碱均为难溶性药物，在0.01 mol/L HCl溶液中溶解度大大低于0.1 mol/L HCl溶液中的溶解度，即溶解一定质量药物所需的0.01 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl溶液体积相差很大.制备药物－树脂复合物时，选择0.1 mol/L HCl溶液作为溶解药物的溶液.

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