小鼠硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶Hs2st的生理功能和体外应用

谢观莲,李学亮,钟卫鸿

(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310032)

小鼠硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶Hs2st的生理功能和体外应用

谢观莲,李学亮,钟卫鸿

(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310032)

硫酸乙酰肝素(HS)是由多个硫酸化结构的二糖单位重复形成的线型多糖,并以共价键形式与核心蛋白质连接形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,而硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶(Hs2st)为硫酸乙酰肝素多糖链硫酸化修饰的主要硫酸基转移酶,它将硫酸基团转移至L-艾杜糖残基的C2位。研究表明,HS的2-O-硫酸化对于HS与众多生长因子或受体进行相互作用是很重要的。缺乏功能性酶Hs2st的胚胎只能存活至出生前,临产时会由于无法形成完整的肾脏而死亡。这种致命性暗示了HS的2-O-硫酸化在小鼠胚胎发育过程中有着重要的作用。从形态学和分子水平上对Hs2st在小鼠胚胎发育过程中的重要性及其在肝素/HS合成过程中的作用进行了综述。

硫酸乙酰肝素;硫酸乙酰肝素-2-O-硫酸基转移酶(Hs2st);小鼠;肝素/HS合成

硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate preteoglycans,HSPG)是基底膜(Basement membrane,BM)中普遍存在的重要成分。HSPG能够结合BM的层粘连蛋白、Fibulin和Ⅳ性胶原等多种成分,BM以外的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)如纤维连接蛋白等多种成分也能与HSPG结合。HSPG与细胞外多功能信号分子的结合是通过变化多样的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)链来进行的[1]。

基底膜糖蛋白与成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)等细胞因子及其细胞膜受体结合时修饰和调节多种细胞内信号的功能分子,不仅参与胚胎器官发生、血管再生和组织重建,而且在癌细胞增殖、转移和浸润过程中起着重要的作用。研究表明,这些作用不仅与HS的多糖链有关,而且与其多糖链的修饰程度有关。参与HS多糖链修饰的酶主要有N-脱乙酰/N-硫酸化转移酶(NDST)、C5-异构酶和O-硫酸转移酶。在这些酶中,硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶(Hs2st)将硫酸基团转移至L-艾杜糖残基的C2位。艾杜糖残基的C2位是HS的常见成分,在许多天然的HS多糖链上均发现了不同量的已硫酸化的艾杜糖残基[2-4]。

目前医药级别的肝素均由动物组织中提取得到,虽然利用动物组织提取肝素方法简单、易操作,但是由于肝素的需求量不断增加,仅仅通过动物组织提取获得肝素已经无法满足需求,此外,2008年的过硫酸软骨素污染事件,也让人们质疑从动物体提取肝素的安全性。因此,安全生产肝素和硫酸乙酰肝素已成为迫切需要解决的问题。

1 Hs2st的酶学和分子生物学特性

1.1 Hs2st的克隆表达

一般RT-PCR扩增后,在胚胎及成年小鼠的多种组织中均可检测到Hs2st m RNA表达,且表达水平较高。Wlad等[4]从小鼠肥大细胞组织中纯化得到一种60 k Da的酶,可以同时催化2-O和6-O硫酸基转移。Kobayashi等[5]和Habuchi等[6]从CHO培养细胞中分别提取纯化得到44 k Da Hs2st和52 k Da Hs6st,与Wlad等获得的O-硫酸基转移酶有区别,说明肝素和HS之间的O-硫酸化和N-硫酸化过程的分子组织是不一样的。为了明确这些不同之处,Kobayashi等[7]从CHO cDNA文库中通过探针筛选获得编码Hs2st的基因序列,其cDNA包含一个1068 bp的可读框,编码一条由356个氨基酸残基组成的多肽链。

Hs2st cDNA(NCBI序列号D88811)的氨基端包含4个ATG密码子。将第一个ATG所在的序列与真核表达翻译后的序列[8]对比,发现-3位的碱基是不保守的,而+4位的碱基G则是保守的。Thornberry等[9]研究表明,在缺失-3位碱基的情况下,+4位的碱基G对于高效翻译十分重要。其它3个ATG所在的序列(Met7、Met8、Met24)也与翻译序列部分一致。这些ATG的-3位置分别是A、A、G,而+4位置不是G,分别是A、C、C。然而第4个ATG密码子(Met24)在氨基端的跨膜区,因此不可能成为起始位点。根据氨基酸序列可知,从CHO细胞中克隆获得的Hs2st属于Ⅱ型跨膜蛋白。在氨基末端,有一段疏水端紧接在一段很短的细胞溶质亲水端之后,这段亲水端作为未裂解的信号锚定序列。在疏水端之后是一段可能朝着高尔基体内腔的亲水端。这些特征与其它的高尔基蛋白类似,如肝素/HS N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶[10-12]。

Kobayashi等[7]将全长cDNA与真核表达载体连接后在COS-7细胞中表达,Hs2st的活性与对照组相比提高了2.6倍,且融合蛋白FLAG-Hs2st经过纯化后只呈现出Hs2st的活性。Liu等[13]通过p MAL-c2X与Hs2st全长cDNA(Arg51～Asn356)连接,导入大肠杆菌进行原核表达,得到的融合蛋白MBPHs2st纯化后在SDS-PAGE上检测得到75 k Da的条带,且纯化率高于80%。融合蛋白MBP-Hs2st即使不切除MBP标签也能表现出Hs2st的活性且高度可溶。

1.2 Hs2st的活性及底物特异性

Liu等[13]在用酶合成法修饰HS的过程中,先将O-硫酸基转移酶固定化,能使其活性更加稳定。检测O-硫酸基转移酶的活性需要3′-硫酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)作为硫酸化转移酶的供体。PAPS再生体系最初是由Burkart等[14]研究得到的,应用于肝素和硫酸乙酰肝素的酶学合成。当硫酸基团转移到受体上时,PAPS转变为3′-磷酸腺苷-5′-磷酸(PAP)。然而, PAP会抑制HS硫酸转移酶的活性,同时在毫克级别合成HS过程中很难将其去除。PAPS再生体系中,芳香磺基转移酶(AST-Ⅳ)催化硫代对硝基苯酚(PNPS)转变为对硝基苯酚(PNP)释放硫酸基团,同时催化PNP转变为PAPS。因此,HS硫酸基转移酶利用PNPS作为硫酸基供体,而不是PAPS(图1)[14,15]。Liu等[13]以CDSNS heparin作为底物、[35S] PAPS作为硫酸基供体,通过比较结合的35S的量来检测Hs2st的修饰程度。

图1 PAPS再生体系Fig.1 PAPS Regeneration system

Chen等[16]研究了从小鼠肥大细胞组织中获得的Hs2st的底物特异性。他们将不一样的多糖作为硫酸受体底物检测Hs2st的修饰程度,结果表明,以O位脱硫酸化的肝素(由[(4)αIdo A(1)-(4)αGlc NSO3(1)-]n组成)作为底物时,经过Hs2st修饰获得2-O-硫酸化的艾杜糖醛酸;而以从E.coli K5中获得的N位硫酸化的荚膜多糖[(4)βGlc A(1)-(4)αGlc NSO3(1)-]n作为底物时,硫酸基仅被转移至葡萄糖醛酸的C2位;此外,如果底物同时含有艾杜糖酸和葡萄糖醛酸残基,那么硫酸基更趋于转移至艾杜糖酸残基的C2位。

2 Hs2st在小鼠胚胎发育过程中的作用

通过基因诱捕策略已证实在编码Hs2st基因中存在隐性致死插入突变[3,17]。此策略是通过将载体插入到该基因的开放阅读框中的内含子进行的。其中,载体的拼接受体5′端于框内融合至lac Z报告基因中。此外,该载体不仅在内源基因的表达上起作用,而且会截断内源转录,因此是可诱变的。这种突变会导致Hs2st的失活,进而生成完全缺少2-O-硫酸基团的HS[18]。

研究者从Hs2st-/-胚胎成纤维细胞中纯化获得未进行2-O-硫酸化的HS,暗示了HS生物合成酶之间的调控影响。奇怪的是,这种不规则的HS虽然能与一定的生长因子结合,但却抑制了野生型HSPGs作为共同受体的功能。尽管如此,Hs2st-/-小鼠的表型明确地说明了HS的2-O-硫酸化在多数器官的发育中的重要性。

2.1 Hs2st对肾脏发育的影响

在Hs2st-/-新生小鼠的泌尿生殖器部位,肾脏缺失,仅有盲管状的尿管存在,但副肾、膀胱和卵巢等其它器官基本正常[19]。后肾是通过2个中胚层诱导体——上皮尿管芽(UB)与后肾间质(MM)相互作用而形成的。HS可以在肾脏中找到,但却是以一种最高浓度形式存在于UB和MM间的基底膜中[20,21]。输尿管芽反复延伸、分支,最终形成集合管。在纯合型变异小鼠胚胎中几乎未发现尿管芽分支,也未见明确的间充质凝集,提示肾脏发生停止而不是延迟[22]。可以认定,尿管周围的间充质聚合和尿管分支结构形成过程中必须有Hs2st基因。尿管芽上皮不表达Hs2st基因,仅于后肾间充质高表达,由此能充分说明纯合子胚胎肾脏形态发生的异常。

2.2 Hs2st对中枢神经系统形成的影响

中枢神经系统的形成和修饰是通过神经管上分泌的信号分子作用而进行的。神经管是一种柱状上皮,最初是单个的厚层。在发育早期,神经系统就呈向脊髓及背脊髓两种模式。随后,内表层的神经管发育成神经前体,通过细胞周期形成不一样的分化神经元,并迁移至神经外表层,使得神经管不断加厚并确定了分化神经元多个分层的最终组成。在Hs2st-/-突变体中,尽管Hs2st在底板区(Floor plate region)和顶板区(Roof plate region)大量表达[3],背脊髓的神经模式仍然不受影响,向脊髓模式也正常发生。在大脑皮层和脊髓的加厚过程中,虽然Hs2st突变体的量有轻微减少现象,但Hs2st突变体却是可再生的。与此同时,那些表达Hs2st的组织中的神经前体扩散量也呈减少趋势。

2.3 Hs2st对骨骼发育的影响

在大多数骨骼中,软骨模型形成最早,于妊娠中后期就开始形成。在每根骨头的特定形成时间内,存在于各自特有成分中央的软骨细胞会退出细胞周期,且变大,最后被成骨细胞退化,进而形成矿化骨。骨骼中的软骨内部是通过相同的软骨不断增殖而形成的。软骨存在于长骨的任意一端。双向信号调节一系列发生在软骨及其周边的组织(软骨膜)的活动,这些活动导致细胞从增殖库中移除,并且使得细胞过分增大,最后被矿化骨替换[23,24]。软骨膜和生长板间的互惠信号能够维持母细胞的增殖和软骨的特异化间的平衡,以确保骨骼能继续生长。组成大多数头盖骨的骨头都有着不一样的形成过程,称作膜内成骨,在此过程中,神经嵴衍生细胞直接特异化为成骨细胞且不需要软骨雏形便能产生矿化骨。从Hs2st-/-小鼠中可具体观察到骨骼石灰化增加、胸骨异位骨化、颈部脊椎骨融合。Hs2st基因在骨骼形成期间的软骨膜上高度表达,表明这些表达模式与骨骼的异常发生密切相关[25]。

2.4 Hs2st对小鼠其它组织器官形成的影响

其它一些较小但却是可再生的缺陷也是很明显的。视网膜色素上皮细胞分化造成的虹膜双向缺损现象多见于新生同质接合体[21]。在突变体中,不正常的视网膜色素上皮细胞于交配后12.5 d时就已经很明显,Hs2st同质接合体中生殖系统的发育在雄性体中是完全正常的,然而在雌性性分化途径中却出现畸形的现象。雌性体内脏中的大肠稍微短一点,继发腭裂也很常见,其在突变体中发生的概率约为50%,这是因为骨化被扰乱,或者是因为2-O硫酸化的HS在前后轴的延伸中起到的辅助作用[21]。

3 Hs2st在肝素/HS合成过程中的作用

肝素和HS有共同的合成途径,研究HS的生物合成机制为改变HS在细胞中的合成提供了基础。不同于蛋白质和核酸,多糖的合成是没有模板的,是在表达水平上控制其特定的蛋白序列。HS的生物合成在高尔基体中进行,然而其核心蛋白质的生物合成是在内质网(ER)上进行的。总之,HS的生物合成是一个复杂的过程,包括骨架的延伸和修饰。

3.1 酶学方法合成肝素/HS的研究

酶学方法合成HS是基于HS在生物体内合成的代谢途径,利用来自微生物合成的Heparosan,在各种体外重组的HS生物合成酶的催化作用下合成HS。利用生物合成酶合成的HS具有抗凝血活性。已有报道利用生物合成酶合成HS,其中含有AT结合位点,虽然产量仅达到微克级别,但得率为1.1%,明显高于化学合成的0.5%,说明此方法是可行的。Lindahl等[22]利用来自大肠杆菌的荚膜多糖Heparosan,采用化学方法和酶法合成抗凝血肝素的类似物,已经得到AT结合戊糖、抗凝血剂HS、抗凝血CDSNS肝素、3-O-辛糖。

3.2 Hs2st对Heparosan进行硫酸化修饰

通过酶学方法对Heparosan进行多糖硫酸化修饰,从而得到多糖类似物,硫酸化转移酶进行硫酸化修饰时需要硫酸基供体PAPS。参与Heparosan硫酸化衍生物合成的酶主要有N-脱乙酰/N-硫酸化转移酶(NDST)、2-O-硫酸转移酶、6-O-硫酸转移酶、3-O-硫酸转移酶等。

首先对Heparosan进行N位的脱乙酰及N位的硫酸化,通过核磁检测结构图比对N位的处理情况,接着,C5-异构酶对Heparosan骨架进行异构化,不同的硫酸基转移酶对相应的O位进行硫酸化修饰。Heparosan骨架在N-脱乙酰/N-硫酸基转移酶的催化作用下脱乙酰基团生成N-硫代葡萄糖胺(Glc NS),同时将磺酸基转移至N-葡萄糖胺。N-硫酸化骨架生成后,C5-异构酶将葡萄糖醛酸(Glc UA)单位异构化为艾杜糖醛酸(Ido UA),其后多糖侧链分别经过2-O-硫酸基转移酶、6-O-硫酸基转移酶、3-O-硫酸基转移酶硫酸化修饰得到HS[14-16],其中Hs2st将硫酸基团转移至L-艾杜糖残基的C2位。

4 结语

深入研究Hs2st的生物学功能和体外应用可以为探讨Hs2st在多种生物中的作用机制奠定基础。此外,通过研究小鼠体内Hs2st引起突变或是其它的HS生物合成酶引起突变的现象能很好地解释HS在胚胎发生过程中的功能模型,且易于进行生物化学、细胞生物学及胚胎学的分析。

从动物组织中提取肝素存在安全隐患,且采用传统化学方法合成肝素效益低,因此酶学方法制备肝素受到了人们的广泛关注。硫酸化多糖近年来已用于预防和临床治疗某些疾病,而它们的治疗作用主要与增加其分子量及硫酸化程度相关,Hs2st的研究将为有关疾病的治疗提供新的靶点。

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Physiological Function and in vitro Application of Mouse Heparan Sulfate 2-O-Sulfotransferase

XIE Guan-lian,LI Xue-liang,ZHONG Wei-hong
(College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032,China)

Heparan sulfate is a linear polysaccharide found in all animal tissues.2-O-sulfation within HS, particularly of iduronate residues,is essential for HS to participate in a variety of high-affinity ligand-binding interactions and signaling processes.Heparan sulfate 2-O-sulfotransferase(Hs2st)catalyzes the transfer of sulfate to the C2-position of selected hexuronic acid residues within the maturing HS.Previous studies have concluded that 2-O-sulfation of HSis essential for it to cooperate in many growth factor/receptor interactions.Surprisingly therefore,embryos lacking functional Hs2st survive until birth,but die perinatally,suffering complete failure to form kidneys.However,this rather late lethality belies a more intricate involvement of 2-O-sulfated HS during development.The purpose of this review is to summarize the requirements for Hs2st during mouse development at the morphological and molecular level,and its role in the synthesis of heparin and HS.

heparan sulfate;heparan sulfate 2-O-sulfotransferase(Hs2st);mouse;synthesis of heparin and HS

Q 781

A

1672-5425(2013)07-0001-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.001

国家自然科学基金资助项目(21076195),教育部博士点基金资助项目(2011331711004),浙江省科技厅国际合作项目(2011C24007)

2013-04-08

谢观莲(1987-),女,福建龙岩人,硕士研究生,研究方向:酶学与基因工程,E-mail:xieguanlian@163.com;通讯作者:钟卫鸿,教授,博士生导师,E-mail:whzhong@zjut.edu.cn。