一株高效石油降解菌的紫外微波复合诱变改良

张云波,刘海涛,赵雅坤

(中国石油大学(华东)环境与安全工程系,山东青岛266580)

一株高效石油降解菌的紫外微波复合诱变改良

张云波,刘海涛,赵雅坤

(中国石油大学(华东)环境与安全工程系,山东青岛266580)

运用紫外、微波复合诱变技术,对高效石油降解菌KO5-2-11进行改良,根据致死率曲线,选择紫外诱变时间为100 s、微波诱变时间为45 s。经过连续4次紫外诱变,得到紫外诱变改良菌UV2;将其作为微波诱变的出发菌株,经2次微波诱变,最终得到遗传稳定的高效耐高温石油降解菌UM2-6。比较KO5-2-11和UM2-6的温度耐受性发现,UM2-6的耐高温性能良好,在55℃的高温下仍具有27.42%的石油降解率,其最高石油降解率出现在45℃,达到48.72%,较KO5-2-11提高20.81%,改良效果明显。

石油降解菌;耐高温;紫外微波复合诱变;改良

新疆地区夏季高温干旱,石油污染土壤日益严重,迫切需要高效的耐高温石油降解菌进行生物修复。作者运用高效的紫外、微波复合诱变技术对现有菌种进行改良,提高其温度耐受性和最适生长温度,得到在高温环境下石油降解效率较高的菌株,拟为高温干旱地区的石油污染土壤修复提供技术支持。

1 实验

1.1 材料与仪器

石油:采自新疆百口泉井区,密度0.792 g· cm-3,粘度1923.14 mPa·s(50℃),饱和烃含量71.17%,芳香分含量18.42%,胶质含量9.89%,沥青质含量0.52%。

OIL-510型全自动红外分光测油仪,北京华夏科创仪器技术有限公司;HZQ-QX型全温振荡器,哈尔滨东联电子技术开发有限公司;BCM-1000型生物净化台。

1.2 菌种与培养基

菌种:从克拉玛依石油污染土壤中筛选得到高效石油降解菌KO5-2-11,红球菌属,最适生长温度为30℃,最高耐受温度为50℃。

无机盐培养基(MSM)[1]:Na2HPO40.6 g, KH2PO40.2 g,Na NO34.0 g,MgSO40.3 g,CaCl20.01 g,FeSO40.01 g,酵母粉0.5 g,蒸馏水1000 mL, p H值7.0。

LB培养基(g·L-1):胰蛋白胨10.0,酵母浸出膏5.0,NaCl 5.0,琼脂20.0(固体培养基用),p H值7.2～7.4。

1.3 方法

采用平板菌落计数法,统计诱变前后菌落数,计算致死率,绘制致死率曲线,据其选择合适的诱变时间。先将KO5-2-11菌悬液进行紫外诱变,再将石油降解效果最好的紫外诱变菌株作为出发菌株进行微波诱变,筛选得到复合诱变的改良菌。

1.4 石油降解率的测定

初始石油含量据培养基添加石油前后的质量差获得。培养后培养基中的石油含量采用全自动红外分光测油仪测定。测定参照GB/T16488-1996《水质、石油类和动植物油的测定-红外光度法》,并稍做改进,采用循环水式真空泵将萃取液抽入抽滤瓶中。为了保证脱水效果,将无水Na2SO4的厚度加大为15 mm[2]。

2 结果与讨论

2.1 紫外诱变改良

2.1.1 紫外诱变剂量的确定

向直径9 cm的培养皿中加入浓度为1×108cfu ·m L-1的菌悬液5 m L,打开紫外灯,预热20～30 min,在距离为80 cm、功率为15 W的2根紫外灯下照射后,吸取0.1 m L涂布于含油固体平板上,在50℃生化培养箱中避光培养48 h,统计诱变前后的菌落数[3,4]。菌株的紫外诱变致死率如图1所示。

图1 紫外诱变致死率曲线Fig.1 The lethal rate curve for UV mutagenesis

研究发现,正向突变多发生在低剂量的诱变中,因此,在诱变研究中,适宜使用致死率为70%～80%的相对剂量[5]。由图1可知,随着紫外诱变时间的延长,石油降解菌的致死率急剧上升;当紫外诱变超过一定时间后,致死率上升缓慢直至几乎不变。紫外诱变时间100 s的致死率为73.86%,介于最适致死率70%～80%之间,因此选择紫外诱变时间为100 s。

2.1.2 紫外诱变菌种的筛选结果

实验发现,经过连续4次紫外诱变以后,正突变率趋于稳定,因此,选择第4次紫外诱变时进行筛选。初筛得到52株菌,挑选生长旺盛的27个菌落进行转接,连续3次后,得到6株菌(编号UV1～UV6)[6],将它们移入100 m L石油含量为1%的无菌MSM培养基中,在160 r·min-1、50℃下暗室培养7 d,其对原油的降解现象及降解率如表1所示。

表1 紫外诱变菌株对石油的降解情况及降解率Tab.1 The phenomenon and petroleum degradation rate for UV mutagenesis strains

由表1可知,6株菌中,UV2的降解效果明显好于其它5株菌,1%石油的降解率达到38.63%。因此,选择UV2作为微波诱变的出发菌株。

2.2 微波诱变改良

2.2.1 微波诱变剂量的确定

将5 m L UV2菌悬液加入到10 m L试管中,用2450 MHz、800 W微波诱变处理,每隔5 s,置于冰上冷却至室温,如此交替进行,诱变结束后,吸取0.1 m L涂布于含油固体平板上,然后在50℃生化培养箱中避光培养48 h,统计诱变前后的菌落数[7,8]。菌株UV2的微波诱变致死率如图2所示。

图2 微波诱变致死率曲线Fig.2 The lethal rate curve for microwave mutagenesis

由图2可知,随着微波诱变时间的延长,石油降解菌的致死率急剧上升;当微波诱变超过一定时间后,致死率上升缓慢直至几乎不变。微波诱变40 s和50 s的致死率分别为69.39%和81.45%,因微波诱变剂量范围应使诱变致死率在70%～80%之间,因此选择微波诱变时间为45 s。

2.2.2 微波诱变菌种的筛选结果

实验发现,经过连续2次微波诱变以后,正突变率达到稳定,因此,选择第2次微波诱变时进行筛选。初筛得到47株菌,挑选生长旺盛的21个菌落进行转接,连续3次后,得到9株菌(编号UM2-1～UM2-9),将它们移入100 m L石油含量为1%的无菌MSM培养基中,在160 r·min-1、50℃下暗室培养7 d,其对原油的降解现象及降解率[9]如表2所示。

表2 微波诱变菌株对石油的降解情况及降解率Tab.2 The phenomenon and petroleum degradation rate for microwave mutagenesis strains

由表2可知,9株菌中,UM2-6的降解效果显著高于其它8株菌,1%石油的降解率达到44.43%。将UM2-6转接4次考察其遗传稳定性,培养7 d后石油的降解率稳定在42.24%～44.79%之间,遗传稳定。因此,选择UM2-6作为紫外、微波复合诱变的改良菌。

2.3 高效耐石油降解菌UM2-6的温度耐受性

将KO5-2-11和UM2-6分别移入100 m L石油含量为1%的无菌MSM培养基中,在160 r·min-1条件下,分别于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃培养7 d,测定石油降解率,比较改良前后对温度的耐受性[10],结果见图3。

图3 KO5-2-11和UM2-6的温度耐受性比较Fig.3 Comparison of temperature tolerance between KO5-2-11 and UM2-6

由图3可知,UM2-6在45℃时石油降解率达到最高,为48.72%,明显高于KO5-2-11的27.91%;在50℃时,KO5-2-11的石油降解率仅有14.29%,而UM2-6石油降解率为43.14%,仍具有明显的石油降解能力;在55℃时,KO5-2-11的石油降解率低至8.36%,基本丧失了石油降解能力,而UM2-6仍有27.42%的石油降解率,耐高温性能良好。

3 结论

(1)以实验室现有的高效石油降解菌KO5-2-11为改良出发菌种,根据致死率曲线,确定紫外诱变时间为100 s、微波诱变时间为45 s,先后进行4次紫外和2次微波复合诱变,最终改良得到遗传稳定的耐高温石油降解菌UM2-6。

(2)对KO5-2-11和UM2-6进行温度耐受性比较,结果表明,UM2-6的耐高温性能良好,在55℃的高温下,仍具有27.42%的石油降解率,其最高石油降解率出现在45℃,达到48.72%,较KO5-2-11提高20.81%,改良效果明显。

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UV-Microwave Mutagenesis Improvement on An Efficient Petroleum Degradation Strain

ZHANG Yun-bo,LIU Hai-tao,ZHAO Ya-kun
(Department of Environmental and Safety Engineering, China University of Petroleum,Qingdao 266580,China)

UV-Microwave mutagenesis technique was used to improve the efficient petroleum degradation strain KO5-2-11.Based on the lethal rate curves,the mutagenesis time of UV and microwave were determined as 100 s and 45 s,respectively.After the accumulation of UV mutagenesis for four times,the improved strain UV2 was achieved,which could be used as the original strain for microwave mutagenesis.After twice microwave mutagenesis,an efficient petroleum degradation strain UM2-6 with high genetic stability and thermostability was finally obtained.The thermostablity comparison between KO5-2-11 and UM2-6 showed that under the high temperature of 55℃,UM2-6 still had a petroleum degradation rate up to 27.42%with high heat tolerance,and the maximum petroleum degradation rate was 48.72%at 45℃,20.81%higher than that of KO5-2-11,showing obvious effect of improvement.

petroleum degradation strain;thermostable;UV-microwave mutagenesis;improvement

X 53

A

1672-5425(2013)07-0071-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.019

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(11CX06048A)

2013-04-16

张云波(1965-),女,四川德阳人,副教授,主要从事生物技术在环境保护中的应用研究。