石墨炉原子吸收光谱法测定细胞中微量金属元素铁、铜、锰的含量

丁 冲,谢 丽,商 澎

(西北工业大学生命学院空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室,陕西西安710072)

石墨炉原子吸收光谱法测定细胞中微量金属元素铁、铜、锰的含量

丁 冲,谢 丽,商 澎

(西北工业大学生命学院空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室,陕西西安710072)

采用石墨炉原子吸收光谱法进行细胞中微量金属元素铁、铜、锰含量的测定。分别针对贴壁培养的成骨细胞MC3T3-E1和悬浮培养的白血病细胞K562进行量化分析,依据细胞总数和细胞内总蛋白含量进行归一化处理,所得结果与文献报道具有较好的一致性。该方法灵敏度高,重复性好,适用于培养细胞中铁、铜、锰等微量金属元素的定量测定,为微量金属元素在细胞中的作用以及细胞组分研究提供实验依据。

石墨炉原子吸收光谱法;微量金属元素;成骨细胞;白血病细胞

化学元素在细胞生命活动中的作用以及与癌症的关系一直受到研究者的关注,其检测在临床诊断中也具有重要的作用。研究显示铁元素在体内的含量与直肠癌等多种癌症的发生呈现正相关[1];铜过量时会导致细胞产生氧化损伤;在癌症转移的动物模型中观察到锰超氧化物歧化酶的表达增加[2]。

生物样品中金属元素含量非常低,由于在体外常规培养的细胞中数量有限导致对培养细胞内金属元素含量的检测更加困难,如铁和铜在人结肠癌细胞HT-29中的含量分别为10～20 ng·(106cells)-1和4～8 ng·(106cells)-1[3]。另外,样品处理过程中易发生交叉污染等,导致微量金属元素的定量检测成为具有挑战性的任务。基于样品量少、高灵敏度的要求,全反射X-射线光谱法、流动注射电感藕合等离子体质谱法和石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)已成功用于培养细胞中微量金属元素的检测分析[4],在实际检测中根据检测元素和样品的不同可选择不同方法。

作者以贴壁培养的成骨细胞MC3T3-E1和悬浮培养的白血病细胞K562为研究对象,采用准确、稳定的GF-AAS方法检测两种细胞内微量金属元素铁、铜、锰的含量,再分别进行细胞计数和总蛋白测定,定量描述细胞内的元素含量,拟为相关研究提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1(澳大利亚悉尼大学周虹教授惠赠);人白血病细胞K562(第四军医大学生物技术中心惠赠)。

α-MEM培养基、1640培养基、FBS血清,美国Hyclone公司;胰蛋白酶,美国Amresco公司;1000μg ·m L-1铁、铜、锰标准溶液,国药集团化学试剂有限公司;硝酸、氯化钠,优级纯,西陇化工股份有限公司; BCA蛋白测试试剂盒,美国Thermo Scientific公司;实验用水为超纯水(18.2 MΩ)。

ZEEnit700P型原子吸收光谱仪,德国Analytik Jena公司;CO2培养箱,德国Heraeus公司;CKX41型倒置显微镜,日本Olympus公司;Biofuge Stratos型台式高速冷冻离心机,美国Thermo Scientific公司; Synergy HT型多功能酶标仪,美国Bio-Tek公司;Vicell XR型全自动活细胞分析仪,美国Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1培养采用添加10%FBS的α-MEM基本培养基。人白血病细胞K562培养采用添加10%FBS的1640基本培养基。

1.2.2 样品制备

1.2.2.1 小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1

取一定数量对数生长期的细胞,弃上清;用胰酶消化细胞,并用生理盐水洗细胞3次,800 r·min-1离心10 min,弃洗液;第3次洗涤时记录细胞悬浮液体积,混匀后取出1 m L用于细胞计数;同时取200μL置于1.5 m L离心管中,于15 000 g、4℃离心15 min后弃上清,加入40μL细胞裂解液,室温放置10 min后, -20℃保存用于总蛋白检测;剩余细胞悬浮液于15 000 g、4℃离心15 min后取出,弃上清,加入40μL纯硝酸,混匀,60℃孵育2 h,-20℃保存备用。

1.2.2.2 人白血病细胞K562

取一定数量对数生长期的细胞,混匀收集到离心管内,800 r·min-1离心10 min,弃上清;用生理盐水洗细胞3次,800 r·min-1离心10 min,弃洗液;第3次洗涤时记录细胞悬浮液体积,混匀后取出1 m L用于细胞计数;同时取200μL置于1.5 m L离心管中,于15 000 g、4℃离心15 min后弃上清,加入40μL细胞裂解液,室温放置10 min后,-20℃保存用于总蛋白检测;剩余细胞悬浮液于15 000 g、4℃离心15 min后取出,弃上清,加入40μL纯硝酸,混匀,60℃孵育2 h,-20℃保存备用。

1.2.3 原子吸收光谱仪的工作参数(表1)

表1 原子吸收光谱仪的工作参数Tab.1 Working parameters of atomic absorption spectrometer

1.2.4 原子吸收光谱仪的石墨炉参数(表2)

1.2.5 细胞中微量金属元素含量的测定

将备用样品溶解后加入9960μL超纯水将硝酸浓度降为4‰,混匀后用石墨炉原子吸收光谱法测定消解细胞样品中铁、铜、锰元素含量,每个样本重复检测3次。

1.2.6 细胞计数和总蛋白的测定

将用于细胞计数的样品混匀,分别采用血球计数板和全自动细胞计数仪进行计数,每个样本重复计数3次。细胞总蛋白的测定采用BCA法,按照BCA蛋白测试试剂盒的步骤进行,每个样本重复测试3次。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线方程

将1000μg·m L-1铁、铜、锰元素标准溶液用4‰HNO3依次梯度稀释至浓度为50 ng·m L-1、50 ng· m L-1、10 ng·m L-1。原子吸收光谱仪自动将各元素的标准品按5个浓度梯度等差稀释后进样,绘制标准曲线并拟合数据,其回归方程见表3。

表2 原子吸收光谱仪的石墨炉参数Tab.2 Graphite furnace parameters of atomic absorption spectrometer

表3 铁、铜、锰元素的标准曲线回归方程Tab.3 The regression equations of standard curves for elements Fe,Cu and Mn

2.2 细胞中铁、铜、锰元素的含量

按1.2.5方法测得的是所检测样品的原始元素含量,不能定量反映细胞中该元素的含量。依据1.2.6方法测得的细胞数目和细胞总蛋白含量进行归一化处理,分别得出每个细胞中铁、铜、锰元素的含量以及单位质量细胞中各元素的含量,结果见表4。

2.3 细胞中铁、铜、锰元素的加标回收率

采用标准加入法,在制备的备用样品中加入铁、铜、锰元素的标准品20 ng·m L-1、10 ng·m L-1、2 ng·m L-1,在选定参数条件下采用石墨炉原子吸收光谱法测定加标后样本的铁、铜、锰元素含量,计算平均回收率。结果表明,铁、铜、锰元素的加标回收率分别为102.5%、90.8%、105.7%,均符合相关要求。

表4 MC3T3-E1细胞和K562细胞内铁、铜、锰元素含量Tab.4 The contents of iron,copper and manganese in MC3T3-E1 cell and K562 cell

2.4 讨论

将测得的MC3T3-E1细胞和K562细胞中铁、铜、锰元素的含量与文献报道的石墨炉原子吸收光谱法检测的其它细胞中的含量进行比较,结果见表5[2,5]。

从表5可看出,所测的K562细胞内铁元素含量为58 fg·cell-1,与文献报道的47.5 fg·cell-1基本一致;锰元素含量为0.073 fg·cell-1,与文献报道的0.9 fg· cell-1稍有出入,这或与样品前处理方法有关。

3 结论

采用石墨炉原子吸收光谱法测定了贴壁培养的成骨细胞MC3T3-E1和悬浮培养的白血病细胞K562中微量金属元素铁、铜、锰的含量,与文献报道相比, K562细胞中铁元素含量基本一致、锰元素含量偏低。该方法灵敏度高、重复性好,可用于培养细胞中铁、铜、锰等微量金属元素的定量测定,为微量金属元素在细胞中的作用以及细胞自组分研究提供依据。

表5 文献报道不同细胞中铁、铜、锰元素的含量Tab.5 Literature survey on the intracellular content of iron,copper and manganese in different cell lines

[1] Huang X.Iron overload and its association with cancer risk in humans:Evidence for iron as a carcinogenic metal[J].Mutat Res, 2003,533(1-2):153-171.

[2] Jin X,Chalmers J J,Zborowski M.Iron transport in cancer cell culture suspensions measured by cell magnetophoresis[J].Anal Chem,2012,84(10):4520-4526.

[3] Szoboszlai N,Réti A,Budai B,et al.Direct elemental analysis of cancer cell lines by total reflection X-ray fluorescence[J].Spectrochim Acta B:Atomic Spectroscopy,2008,63(12):1480-1484.

[4] Szoboszlai N,Polgari Z,Mihucz V G,et al.Recent trends in total reflection X-ray fluorescence spectrometry for biological applications[J].Anal Chim Acta,2009,633(1):1-18.

[5] Polgari Z,Ajtony Z,Kregsamer P,et al.Microanalytical method development for Fe,Cu and Zn determination in colorectal cancer cells[J].Talanta,2011,85(4):1959-1965.

Determination of Contents of Trace Metal Elements Iron,Copper and Manganese in Cells by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

DING Chong,XIE Li,SHANG Peng
(Key Laboratory for Space Bioscience&Biotechnology,School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University,Xi'an 710072,China)

In this paper,the contents of trace metal elements iron,copper and manganese in cells were detected by graphite furnace atomic absorption spectrometry.For different cells including adhere-wall cultured osteoblast MC3T3-E1 and suspension cultured leukemia cell K562,the quantitative analysis was conducted by the normalization based on total number and total protein content respectively.The results showed good consistency with those of literature.In summary,this method was suitable for determination of the contents of Fe,Cu and Mn in the cultured cells with high sensitivity and good repeatability,and provided experimental basis for the research of the role of trace metal elements in cells as well as the cell components.

graphite furnace atomic absorption spectrometry;trace metal element;osteoblast;leukemia cell

O 657.31

A

1672-5425(2013)11-0071-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.11.019

国家自然科学基金资助项目(51147008),高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20126102110055)

2013-09-06

丁冲(1984-),女,陕西三原人,博士研究生,研究方向:生物电磁特性及磁场生物学效应,E-mail:dingchong@mail.nwpu.edu.cn;通讯作者:商澎,教授,E-mail:shangpeng@nwpu.edu.cn。