藏药大三果抗氧化活性研究

项朋志,余 洪,刘 琼,胡显智

(1.昆明理工大学国土资源工程学院,云南昆明650093;2.云南开放大学化学工程学院,云南昆明650222; 3.昆明理工大学理学院,云南昆明650093)

藏药大三果抗氧化活性研究

项朋志1,2,余 洪1,刘 琼2,胡显智3

(1.昆明理工大学国土资源工程学院,云南昆明650093;2.云南开放大学化学工程学院,云南昆明650222; 3.昆明理工大学理学院,云南昆明650093)

研究了藏药大三果药剂三果汤含片及配伍三种成分毛诃子、诃子、余甘子清除超氧阴离子自由基(·)、羟基自由基(·OH)的能力。结果表明,三者清除·能力大小依次为:毛诃子＞余甘子＞诃子,清除·OH能力大小依次为:毛诃子＞诃子＞余甘子。此外,分析毛诃子、诃子、余甘子及三果汤含片中活性成分没食子酸的含量发现,三果汤含片的抗氧化性能主要与三种配伍成分中没食子酸的含量有一定关系。

大三果;抗氧化;超氧阴离子自由基;羟基自由基

大三果由诃子(Fructus chebulae)、毛诃子(Fructus terminaliae billericae)和余甘子(Phyllanthus emblica L.)组成,因为三种果实常配伍联用,或以它们为主药配伍为三果散、三果汤等剂型,所以简称大三果[1,2]。大三果在我国高原藏区有悠久的使用历史和丰富的文献记载。《四部医典》记载其“主治瘟疫、紊乱热症、促使热症成型”。在三果汤散处方配伍配比及用药剂量上,印度传统医药将诃子、毛诃子和余甘子三种药材的比例确定为1∶1∶1,而藏医药会根据临床不同情况而调整比例。

研究发现,自由基除参与三大疾病(心血管疾病、肿瘤、神经兴奋及损伤)的发病过程外,与应激、缺氧等生理急剧反应也密切相关,超氧阴离子自由基(·)、羟基自由基(·OH)是生物体内主要的活性氧自由基,它们引发的体内脂质过氧化是机体衰老、动脉硬化、心血管病及肿瘤发生的重要原因,而使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应,可以抑制机体的自由基损伤,从而保持健康状态和防治相关疾病,延缓衰老[3]。目前针对藏药大三果抗氧化能力研究较少。为此,作者研究了大三果主配方三种成分毛诃子、诃子、余甘子对·、·OH的清除能力,拟为大三果药物使用提供借鉴。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

三果汤含片(Z20030060),成都三勒浆药业集团四川华美制药有限公司;没食子酸对照品、诃子对照药材、毛诃子对照药材、余甘子对照药材,中国药品生物制品检定所。

三羟甲基氨基甲烷、盐酸、邻苯三酚、水杨酸、芦丁(美国Sigma公司)、过氧化氢、硫酸铁、无水乙醇,均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

UV1800型紫外可见分光光度计,日本岛津; PHS-3C型酸度计,金坛科兴;BSA-124D型电子天平,德国赛多利斯科学仪器有限公司;KQ3200E型超声波清洗仪,昆山超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液及对照品溶液的配制

取三果汤含片研细,称取0.1 g置于具塞锥形瓶中,精密称定,精密加入乙醇20 m L,摇匀,称定质量,超声处理15 min,冷却至室温后,称定质量,用乙醇补足减失的质量,摇匀,过滤,精密吸取续滤液1 mL置于10 m L容量瓶中,加入15%乙醇稀释定容,摇匀,即得供试品溶液;分别称取5 g诃子对照药材、毛诃子对照药材、余甘子对照药材,加入20 m L乙醇,超声35 min,过滤后转入到50 m L容量瓶,定容,即得供试品溶液。

精密称取没食子酸对照品4.5 mg置于10 m L容量瓶中,加甲醇适量,超声处理10 min使完全溶解,冷却至室温后加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得0.45 mg· m L-1的没食子酸对照品溶液。

精密称取芦丁对照品5.0 mg置于50 m L容量瓶中,加甲醇适量,超声处理10 min使完全溶解,冷却至室温后加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得0.1 mg·m L-1的芦丁对照品溶液。

精密称取20 mg抗坏血酸,用约1 g·L-1的草酸溶解后定容至100 m L,摇匀,即得0.2 mg·m L-1的抗坏血酸对照品溶液。

在50 m L 0.1 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷中加入12.5 m L 0.1 mol·L-1盐酸溶液,稀释至100 m L,得到p H值为9.0的缓冲溶液,分别加入不同浓度的诃子、毛诃子、余甘子供试品溶液,再加入1 m L 0.2 mmol·L-1邻苯三酚溶液和2 m L蒸馏水,于340 nm处测吸光度。以0.2 mg·m L-1抗坏血酸溶液作为对照。·清除率(D)按下式计算:

式中:A空为不加样液时溶液的吸光度;A样为加样液时溶液的吸光度。

1.2.3 ·OH清除活性的测定

采用Fenton法[5,6]。H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应生成具有很高反应活性的·OH,·OH与水杨酸反应生成有色物质,抗氧化物质加入后,会与水杨酸竞争,有色产物的生成量减少。通过测定吸光度的变化即可分析抗氧化物质对·OH的清除作用。

向试管中加入2 m L不同浓度的诃子、毛诃子、余甘子供试品溶液,依次加2 m L 6.5 mmol·L-1FeSO4溶液、2 m L 2.5 mmol·L-1H2O2溶液,摇匀,静置10 min,再加入2 m L 7 mmol·L-1水杨酸溶液,摇匀,然后35℃水浴25 min,于2500 r·min-1离心12 min,取上清液于500 nm处测吸光度。以0.1 mg·m L-1芦丁溶液为对照。·OH清除率(D′)按下式计算:

式中:A'空为不加样液时溶液的吸光度;A'样为加样液时溶液的吸光度。

1.2.4 没食子酸含量测定

没食子酸含量测定采用酒石酸亚铁法[7]。

2 结果与讨论

图1 余甘子(a)、诃子(b)、毛诃子(c)对超氧阴离子自由基的清除率Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging rate of Phyllanthus emblica L.(a),Fructus chebulae(b) and Fructus terminaliae billericae(c)

从图1可以看出,在0.05～0.25 mg·m L-1浓度范围内,余甘子的·清除率随着浓度的增大逐渐上升,在0.10～0.25 mg·m L-1范围内,清除率与浓度呈一定的线性关系,当浓度为0.25 mg·m L-1时·清除率最大,达到了54.3%,这与文献[1]结果基本一致;诃子和毛诃子的·清除率也随其浓度的增大逐渐上升。进一步计算得到余甘子、诃子、毛诃子及三果汤含片的IC50分别为0.15 mg·m L-1、1.80 mg ·m L-1、0.135 mg·m L-1、1.68 mg·m L-1。总体来看,余甘子、诃子和毛诃子对·的清除能力较好,能力大小依次为:毛诃子＞余甘子＞诃子,其中毛诃子效果最好、诃子效果较差,三果汤含片清除·能力介于诃子和余甘子之间。余甘子、诃子、毛诃子及三果汤含片与0.2 mg·m L-1的抗坏血酸相比较,·清除率均低于抗坏血酸。

2.2 三果汤含片及配伍成分对·OH的清除能力

测定了余甘子、诃子、毛诃子对·OH的清除率,结果见图2。

图2 余甘子(a)、诃子(b)、毛诃子(c)对羟基自由基的消除率Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging rate of Phyllanthus emblica L.(a),Fructus chebulae(b)and Fructus terminaliae billericae(c)

从图2可以看出,随着余甘子浓度的增大,·OH清除率逐渐上升,余甘子浓度为0.8 mg·m L-1时,清除率最大,为81.7%,略低于相同测定条件下芦丁的·OH清除率91.2%,但与文献[7]中余甘子多糖的·OH清除率相当;诃子的·OH清除率最大达到82. 6%,与相同条件下芦丁的·OH清除率87.8%相差不大;毛诃子的最大·OH清除率略低于相同测定条件下芦丁的·OH清除率。进一步计算得到余甘子、诃子、毛诃子和三果汤含片的IC50分别为0.43 mg ·m L-1、0.40 mg·m L-1、0.35 mg·m L-1、0.32 mg·m L-1。总体来看,余甘子、诃子和毛诃子的·OH清除能力较·O-2清除能力更好,能力大小依次为:毛诃子＞诃子＞余甘子,其中毛诃子显示出较强的抗氧化性,这可能和毛诃子中所含的没食子酸含量较高有关。三果汤含片的·OH清除能力要好于余甘子、诃子和毛诃子。

2.3 三果汤含片及配伍成分活性成分分析

根据2005版《中国药典》,余甘子中主要含没食子酸等成分,诃子和毛诃子中主要含没食子酸、芦丁等成分[8],三种配伍成分中均含有没食子酸。在藏药大三果的化学指纹图谱研究中,根据保留时间初步定性了没食子酸等4个成分,其中没食子酸为三果汤散主要化学成分[9]。推测大三果药剂三果汤含片的抗氧化性能可能与其中没食子酸含量有关。4种样品中没食子酸的含量及其清除·、·OH-能力见表1。

表1 4种样品中没食子酸含量及其清除·、·OH能力Tab.1 The gallic acid content of the four samples and their abilities to scavenge·,·OH

表1 4种样品中没食子酸含量及其清除·、·OH能力Tab.1 The gallic acid content of the four samples and their abilities to scavenge·,·OH

样品 没食子酸含量/% IC50/mg·m L-1·O-2· 3.26 0.15 0.43诃子 3.76 1.80 0.40毛诃子 4.83 0.135 0.35三果汤含片OH余甘子3.26 1.68 0.32

从表1可以看出,单味药余甘子、诃子、毛诃子均具有一定的抗氧化作用,且毛诃子抗氧化作用最强,三果汤含片抗氧化能力居中,这说明就抗氧化能力而言,三果汤含片并没有表现出较强的协同作用。从表1还可以看出,没食子酸含量较高时,表现出较强的抗氧化能力,即三果汤含片及配伍成分的抗氧化能力与其中的没食子酸含量有一定关联。值得注意的是,仅以没食子酸含量来说明抗氧化性存在一定的局限性,大三果其它成分也可能参与了抗氧化作用,有必要采用多指标从整体上对三果汤含片进行评价。

3 结论

研究了藏药大三果药剂三果汤含片及配伍三种成分毛诃子、诃子、余甘子清除·、·OH的能力。结果表明,三者清除·能力大小依次为:毛诃子＞余甘子＞诃子,清除·OH能力大小依次为:毛诃子＞诃子＞余甘子。此外,分析毛诃子、诃子、余甘子及三果汤含片中活性成分没食子酸的含量发现,三果汤含片的抗氧化性能主要与三种配伍成分中没食子酸的含量有一定关系。

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Study on Antioxidant Activity of Tibetan Medicine Da San Guo

XIANG Peng-zhi1,2,YU Hong1,LIU Qiong2,HU Xian-zhi3
(1.Faculty of Land Resource Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China;2.College of Chemical Engineering,Yunnan Open University,Kunming 650222,China;3.College of Science,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China)

The scavenging capacity for·and·OH were studied of Tibetan medicine Da San Guo(San Guo soup tablets)and of its three compatibility components Fructus terminaliae billericae,Fructus chebulae, Phyllanthus emblica L..The results showed that the the scavenging capacity followed the order of Fructus terminaliae billericae＞Phyllanthusemblica L.＞Fructus chebulae as·was concerned and the the scavenging capacity followed the order of Fructus terminaliae billericae＞Fructus chebulae＞Phyllanthus emblica L.as far as·OH was concerned.The gallic acid content of Da San Guo soup tablets and its three components were also determined,and the results suggested that the antioxidant activity of Da San Guo soup tablets might be related to the the gallic acid content of its three kinds of compatibility.

Da San Guo;antioxidant;superoxide anion free radical;hydroxyl free radical

O 652

A

1672-5425(2013)11-0027-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.11.007

云南省教育厅科学研究基金资助项目(2011C163)

2013-08-20

项朋志(1978-),男,湖北黄冈人,讲师,研究方向:电化学分析,E-mail:794059143@qq.com。