一株水貂阿留申病细小病毒的分离与鉴定

廉慧锋 （山西出入境检验检疫局 太原 030024）

胡传伟 李 叶 贾 赟 （辽宁出入境检验检疫局 大连）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink, AMD)是由阿留申病病毒(Aleutian disease virus, ADV)引起的一种水貂的传染病。该病毒属细小病毒科，是一种单链的DNA病毒，长度大约4800bp[1，2],在水貂中主要引发两种不同类型的疾病。成年水貂感染ADV后，表现出典型的水貂阿留申病，以体内产生高水平的γ-球蛋白，浆细胞增多，持续性病毒血症及由免疫复合物(immune complex，IC)沉积引发的严重肾小球肾炎等为主要症状。而新生幼貂感染该病后，病毒在病貂体内肺泡II型细胞中迅速大量繁殖，表现出一种急性致死性的间质性肺炎。另外，这两种不同的急、慢病症在有些水貂中的表现轻微或某些水貂感染ADV后不出现明显感染症状的情况，也有相关报道。

国外对目前ADV和AD的研究较为深入,主要集中在ADV分子病原学及AD分子水平的发病机理的探讨。目前国外已报道从不同地区分离到的多株ADV毒株，如ADVG、DV-Utah1、ADV-K等[3～7]。通过对这些毒株的基因进行对比分析,发现ADV具有高度的遗传多样性[7,8,9]。国内对AD的研究起步晚,研究内容比较局限,尤其是基因水平的研究较少。笔者应用对流免疫电泳和聚合酶链式反应2种方法对辽宁某水貂养殖场的水貂进行ADV检测，对PCR产物应用序列分析的方法证实分离到一株ADV病毒，命名为LN-1。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感染阳性病料样品的采集和处理 从辽宁某水貂养殖场具有水貂阿留申病临床症状并且应用对流免疫电泳检测阳性水貂肺、肝、肾、肠系膜淋巴结。

1.1.2 主要试剂 CIEP检测试剂，购自吉林左家特产研究所；TaqDNA聚合酶、dNTP、等均购自宝生物(大连)工程有限公司；组织/细胞DNA抽提试剂盒为上海华舜生物工程有限公司的产品。

1.1.3 菌种与质粒 大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD-18T载体购自于大连宝生物工程公司。

1.1.4 引物 根据Genbank上发表的ADV标准毒株ADV-G的LORF的基因序列设计了一对引物，P1：5’-AAC CAA GCA AGG TGG AAA G-3’(1459-1477)，P2：5’-ATT CTT CGT GGC AGT TGT G-3’(2067-2085)，预期的扩增片断为627bp。

1.1.6 仪器设备 System9700型常规PCR扩增仪购自美国ABI公司、UVP GelDoc-lt凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 样品中DNA提取 样品中总DNA的提取按照组织DNA抽提试剂盒说明书提供的方法进行；质粒提取按文献方法进行[10]。

1.2.2 PCR条件的设置 （1）PCR反应体系：cDNA3μl，10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/L dNTP1μl，P1(20pmol)0.5μl，P2(20pmol)0.5μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，加H2O补至20μl。（2）反应条件：96℃变性4min，96℃30s，50℃1min，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。反应完毕，取PCR产物6μl，置15%琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外线灯下观察。

1.2.3 胶回收、连接以及酶切鉴定 选择肝脏和肠系膜淋巴结样品扩增的PCR产物用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit切胶回收，使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution I，将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体上后命名为CTA544，热转化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落使用RV-M/M13-47引物对进行PCR扩增，检测菌落中插入片段的长度，琼脂糖凝胶电泳，选择阳性克隆使用M13-47、RV-M引物测序。

1.2.4 序列测定及分析 将含有目的基因的阳性菌液送大连宝生物公司测序，将所得的病毒株的基因序列与GenBank中检索到的美国ADV的代表株ADV-Utah1、无致病力的ADV-G及欧洲的代表株ADV-K相对应序列及基于这些基因预测的氨基酸序列利用DNASTAR分析软件进行同源性分析，并构建相应的系统发育进化树。

2 结果

2.1 PCR试验结果

从图1中可以看出P1/P2引物能够特异的扩增ADV基因长度约为600bp片段，而空白对照为扩增出任何条带，见图1。

图1 PCR产物电泳图

图2 重组后质粒DNA使用M13-47、RV-M引物测序结果

图3 ADV分离株LN-1株与国外报道的毒株同源性分析

进化树分析显示:本次分离到的此株病毒基因与美国ADV的代表株ADV-Utah1、无致病力的ADV-G病毒基因处在比较近的进化分支上，而与欧洲的代表株ADV-K的基因的系统关系相对较远（图4），因此可以鉴定此株细小病毒。

图4 DV(分离株LN-1与国外参考毒株)的基因发育进化树

2.2 序列测定及分析

序列测定结果从图2中可以看出P1/P2引物扩增产物的长度为627bp，与预期扩增产物的大小一致，将含有目的基因的阳性菌液送大连宝生物公司测序，将所得的基因序列与GenBank中检索到的美国ADV的代表株ADVUtah1、无致病力的ADV-G及欧洲的代表株ADV-K相对应序列及基于这些基因预测的氨基酸序列利用DNASTAR分析软件进行同源性分析，并构建相应的系统发育进化树。同源性结果显示：扩增得到的基因片段与ADV-Utah1的同源性最高，高达95.4%，与ADV-G，ADV-K的同源性分别为95.2%，87.2%(图3)。

3 讨论

水貂阿留申病在水貂饲养场普遍存在，临床上主要表现的症状为水貂产仔量降低、死胎、流产、肾小球肾炎、动脉血管炎和肝炎，并导致成年水貂的免疫系统紊乱，仔貂突发严重肺炎而死亡。病理剖检常见的是肾肿大、充血而呈红色，后变灰褐色或淡黄褐色，有的表面可见斑点状出血，间有灰白色坏死灶。水貂阿留申病的发病率和死亡率都很高，同时病貂毛皮质量下降，对水貂养殖业造成巨大的经济损失，是世界上公认的养貂的三大疫病之一。

目前国内外尚未研制出有效预防AMD的疫苗，仍只能通过检疫淘汰病貂来实现对本病的控制和根除，对流免疫电泳(CIEP)是现今世界公认的并且是应用最为广泛的检测方法。目前，应用PCR方法检测水貂阿留申病毒的方法的研究也比较少，国内还没有应用荧光定量PCR检测水貂阿留申病的报道。

本试验主要对水貂群进行了ADV的检测并分离到了一株水貂阿留申细小病毒株并进行了鉴定，也对其进行了基因的初步分析，这对将来进一步开展针对该病的诊断和防治研究奠定了基础，对今后深入研究我国AMDV遗传多样性、抗原变异情况以及水貂阿留申病的预防和控制都具有重要意义。

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