高效液相色谱法检测鸡蛋中三聚氰胺残留量的探讨
2013-08-16魏秀丽尹伶灵张呈军
陈 玲 魏秀丽 尹伶灵 张呈军 张 颖
(山东省兽药质量检验所 济南 250022)
近几年来发生的三聚氰胺奶粉、饲料、鸡蛋等事件的曝光,严重影响了畜产品安全[1]。三聚氰胺(化学式:C3H6N6),俗称蛋白精,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被广泛用作化工原料。但因三聚氰胺含氮量高,被不法分子添加于奶粉和饲料中增加蛋白质含量。三聚氰胺奶粉、鸡蛋事件引起了广泛的关注。随后国家及科研机构发布了原料乳、饲料中三聚氰胺的检测标准,有液相色谱法、气质、液质等方法[1-5],但鸡蛋中三聚氰胺的检测方法极少。为了保障鸡蛋食品的安全,本实验室开发了鸡蛋中三聚氰胺残留量的检测-高效液相色谱法。试样经匀质、用三氯乙酸提取、固相萃取柱净化,通过优化色谱条件,采用反反向色谱柱,经紫外检测器检测,外标法定量,线性良好,回收率高,满足检测需求。
1 材料与方法
1.1 仪器
Waters高效液相色谱仪:配紫外检测器。分析天平:感量0.00001g。离心机:8000r/min。组织匀浆机。振荡器。氮吹仪。
1.2 药品及试剂
三聚氰胺标准品(C3H6N6):德国DR.公司C14861400,批号81114,含量99.00%。甲醇、乙腈:色谱纯。三氯乙酸、醋酸铅、氨水、醋酸铵、盐酸均为分析纯。超纯水。MCX弱阳离子交换萃取柱。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件 色谱柱:XBridgeTM Hilic 5µm,4.6×150mm;流动相:10mmol醋酸铵水溶液:乙腈(v/v,5/95)溶液;紫外检测器波长:230nm,流速:1.0ml/min;柱温30℃;进样量为20μl。
1.3.2 三聚氰胺标准储备液(1.0mg/ml)及标准曲线的绘制准确称取50mg三聚氰胺标准物质(精确至0.1mg),用甲醇溶液(50%)溶解后并定容至50ml容量瓶中,混匀,4℃条件下保存,有效期为3个月。准确取适量标准储备液用流动相稀释成0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/ml的系列标准溶液,供高效液相色谱测定。以三聚氰胺标准溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.3 样品制备 提取:鸡蛋样品匀浆,准确称取试样适量2.00+0.05g于50ml试管中,准确加入9ml浓度为1%的三氯乙酸溶液,然后加入1ml饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白,旋涡1min,摇床震荡提取15min,8000r/min离心10min,取上清液备用。净化:分别用3ml甲醇,5ml水活化mcx固相萃取小柱,取5ml提取液过柱后,用0.1mol的盐酸和甲醇洗涤小柱,挤干后用3ml浓度为5%的氨水甲醇洗涤溶液洗脱,收集洗脱液用氮气吹干,最后用1ml流动相溶解,用0.22um的滤膜过滤后,用HPLC测定。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线
在选定的色谱条件下,可以有效的分离三聚氰胺,在0.5-50μg/ml范围内,标准曲线y=3.33×104x+1.08×103(R2=0.9999),线性良好。
2.2 方法的灵敏度
鸡蛋的空白试料按上述的步骤处理后,测定结果表明:在相应的保留时间,空白试料对所测分析物无干扰。空白图谱见图1,三聚氰胺标准图谱见图2,三聚氰胺阳性添加图谱见图3。
图1 空白鸡蛋色谱图
图2 三聚氰胺(1ug/ml)标准色谱图
图3 三聚氰胺(2.5mg/kg)阳性添加色谱图
在空白鸡蛋中添加三聚氰胺标准溶液,分别制成0.5、1、2.5、5mg/kg三个浓度的空白添加样品,按确定的提取净化方法处理后,经高效液相检测,计算信噪比。添加浓度为0.5mg/kg时,三聚氰胺峰信噪比(S/N)>3,确定为方法的检测限,添加浓度为1mg/kg时,三聚氰胺峰峰面积响应值和信噪比满足最低定量限的要求信噪比(S/N)>10,确定为方法的最低定量限。
2.3 方法的精密度和准确度
采用标准添加法,在鸡蛋空白匀浆组织中添加3个不同浓度的三聚氰胺进行回收率试验。三聚氰胺分离良好,无任何干扰物,阳性添加回收率均在70%~100%范围内。鸡蛋中的添加浓度分别为0.5mg/kg(检测限)、1mg/kg(定量限)、2.5mg/kg(MRL)、5mg/kg(2MRL)。各浓度进行5个样品平行试验,重复3次,批内、批间相对标准偏差均小于10%,具体结果见表1。
表1 鸡蛋中三聚氰胺的添加回收实验结果 (%)
2.4 反反相色谱柱、色谱柱寿命长、色谱峰峰形
GB/T22388-2008原料乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法-HPLC中检测三聚氰胺[2]采用的是反相色谱柱,流动相采用的是离子对试剂缓冲溶液乙腈。由于流动相中含有大量的离子对柠檬酸和辛烷磺酸钠,平衡色谱柱和冲洗色谱柱需要时间长,而且容易对色谱柱造成损害,色谱柱寿命较短,经济成本较高。本研究采用反反相色谱柱XBridgeTMhilic色谱柱,与传统色谱柱相比其稳定性和重现性更好,没有采取离子对的流动相,保护色谱柱,使三聚氰胺的分离具有完美的色谱峰形和最高柱效。
3 结论
本方法采用1%三氯乙酸溶液提取、固相萃取柱净化,高效液相色谱法测定,成功建立了鸡蛋中三聚氰胺的残留检测方法。此方法对样品提取、净化过程和仪器条件进行了优化改进,三聚氰胺的检测限为0.5mg/kg,最低定量限为1mg/kg。整个实验过程简单、快速,回收率较高,适合样品鸡蛋中三聚氰胺残留的定量检测。
[1].李红梅, 张庆合, 汤桦等.GB/T 22400-2008 原料乳中三聚氰胺快速液相色谱法[S].北京: 中国标准出版社, 2008.
[2].宋书锋, 鲁杰, 安娟等.GB/T 22388-2008.原料乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法[S].北京: 中国标准出版社, 2008.
[3].蔡勤仁, 欧阳颖瑜, 钱振杰等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺[J].色谱, 2008, 26(3).
[4].冯家望, 蔡勤仁, 柳训才等.高效液相色谱-电喷雾串联技术测定奶及奶制品中三聚氰胺和环丙氨嗪[J].现代食品科技, 2008, 24(10).
[5]魏瑞成, 黄思瑜, 侯翔等.鸡蛋中的三聚氰胺残留的检测[J].江苏农业学报, 2008, 24(6).
[6]汪辉, 彭新凯, 李文丽等.高效液相色谱测定生鲜乳及乳制品中的三聚氰胺的方法研究[J].食品科学, 2008, 29(10).
[7]李志伟, 霍云霞, 刘佳等.高效毛细管电泳法测定奶制品中的三聚氰胺含量[J].食品科学, 2010, 31(2).
[8]吴彩梅, 白洁, 贾刚等.高效液相色谱法测定鸡蛋中的三聚氰胺[J].食品科学, 2011, 32(8).