某规模猪场猪伪狂犬病的诊断

汤起武，蒋大良，刘崇灵，王淑琴，李润成，余兴龙

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 41012 8）

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒（PRV）引起的一种急性传染病。感染猪的临床特征为体温升高，新生仔猪主要表现神经症状，还可侵害消化系统。成年猪呈隐性感染，妊娠母猪感染后可表现流产、死胎及呼吸症状。公猪表现为繁殖障碍和呼吸系统症状［1］。本病的传染源主要是带毒猪和其它带毒动物，病猪可通过分泌物排出病毒，污染猪舍，使健康猪群感染［2］。本病也可以发生于其他家畜和野生动物，在自然条件下能感染猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊、狐等动物［3］。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感，其中以家兔最为敏感。

1 病例介绍

2012年6月，湖南岳阳某500头母猪的规模猪场，7-15日龄哺乳仔猪发病，体温达41℃以上，皮肤略显红黄色。2天后2-7日龄小猪也出现发病症状，少数病猪有腹泻症状，病猪均表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀，最后死亡；少数怀孕母猪出现体温升高，食欲下降，至送检当天有6头母猪出现了流产现象。猪场送检了7-15日龄的发病小猪4头，7日龄以下的发病小猪5头。剖检发现7-15日龄小猪病变不明显，但7日龄以下小猪均表现脑膜有明显出血点，肝、脾有白色坏死点，肾有针尖状出血点，肺有出血点。

2 实验室诊断

2.1 引物的设计与合成

根据GenBank登录的PRV gE基因序列（基因登录号：M14336），应用计算机Primer 软件设计了扩增gE基因的特异性引物，目的片段大小为363bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为：上游引物（gI/Efp）：TTGTGGGTGGCGTTTTATCTCCGTC；下游引物（gI/Erp）：AAGTTGGCGCCCTCGGACACGTTC。

2.2 病料样品DNA 的提取

从5头7日龄以下发病小猪病料中随机选出4份，进行PRV检测，样品DNA的提取参照文献［4］进行。

2.3 PRV的PCR扩增

取设计的引物，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR体系为：基因组模板0.5μL，dNTP（2.5mmol/L） 0.5μL，上游和下游引物（10μmol/L）各1.5μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 酶1μL，5×Buffer10μL，加超纯水至50μL。反应条件为 ：98℃预变性5min；98℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。

2.4 PCR产物的测序分析

将PCR产物进行序列测定并将所测出基因序列进行Blast比对分析。

2.5 家兔接种实验

将6只家兔分成3组：1组接种病料组织，1组接种伪狂犬病毒商品疫苗，另设2只不接种任何物质作为对照组。具体操作为：取2头发病小猪脑组织和肝脏各1g，碾磨加5ml生理盐水匀浆，离心后取上清加双抗至2000单位/mL，无菌过滤备用。1头猪的组织提取液作为一个样本，分别接种2只家兔；疫苗接种组则按疫苗说明书稀释好疫苗后每只家兔接种10头份生猪剂量的疫苗即可。所有家兔均采用皮下接种方法进行接种。

2.6 病原分离鉴定

采集脑部病料，无菌操作将病料剪碎至1.5mL离心管中，加入适量含1%双抗的1640培养基，反复冻融三次之后，用组织匀浆机研碎病料，4℃，12000r/min，离心15min，取上清0.9mL接种单层PK-15细胞，37℃感作1h后加入含2%新生牛血清的1640培养基，置于37℃ CO2培养箱3-5d，观察细胞病变情况，并设正常对照组。

3 结果

3.1 PCR扩增结果

以从病料中提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果见图1，由图1可见4个样品均扩增出了预期大小的目的片段。

3.2 测序结果

将PCR产物进行测序，并将测出序列进行blast比对分析，结果显示为伪狂犬病毒gE基因，与伪狂犬病毒LA株序列（登录号：AY683135）同源性达99%。

3.3 家兔接种实验

用病料和疫苗接种家兔48h后，病料接种组的家兔出现了瘙痒症状，将接种部位全部咬伤（图2），在出现瘙痒症状3-4h后死亡。对照组家兔以及疫苗接种组家兔没有任何异常表现。

图1 PRV PCR扩增结果

测出序列：

图2 病料接种组的家兔

3.4 病原分离鉴定

将病料接种细胞后，发现从24h后有些细胞变圆、固缩，48h后出现明显细胞拉网现象并有大部分细胞脱落（图3），而正常细胞对照组没有出现病变（图4）。将接毒48h后的细胞液反复冻融三次后，取细胞液提取DNA进行PRV的PCR检测，结果见图5。由图5可见接毒细胞扩增出了约363bp的特异性条带，正常细胞未见到任何条带。

图3 病变细胞

图4 正常细胞

图5 接毒细胞PRV检测结果

4 讨论

自1947年我国首次报道伪狂犬病以来，已有20多个省、市、自治区相继报道过本病。总结1998-2007年全国各地区PR野毒感染抗体（gEELISA）流行病学调查的报道，全国PRV猪群感染平均阳性率达20.85%，而湖南为39.59%，高于全国平均水平［5］。根据湖南省畜牧局、湖南省动物疫病预防控制中心和湖南省动物卫生监督所联合发布的2001-2008年湖南猪群主要疫病流行态势与分析显示：近些年来猪伪狂犬病仍是我省传统的主要生猪疫病之一，200l-2006年检测结果显示，每年有20%以上的病例为猪伪狂犬病，2007年和2008年受高致病性猪蓝耳病疫情的掩盖，受检样品减少，但样品阳性率依然保持较高比例，表明其危害程度依然较高［6-7］。邱美珍等自2011年1—11月，先后从湖南省19个规模猪场采集1096份种猪血清、551份仔猪和肥育猪血清样本，利用gE-ELISA（酶联免疫吸附试验）方法对湖南省19个使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗的规模化猪场进行野毒血清抗体的监测与全面分析，结果共检出12份阳性样本，总样品阳性率为0.73%，4个猪场检测到伪狂犬病野毒抗体，猪场阳性率21.05%；显示伪狂犬病仍在湖南省呈地方性流行。但与2008年之前相比，其感染率已经有所下降［8］。

疫苗接种不到位，生猪免疫抗体出现长期的空白期，猪场老鼠猖獗，都可引起发该病发生及传播。因此笔者认为在当前的疾病感染压力下，使用优质的gE基因缺失疫苗强化免疫是控制和净化伪狂犬病的重要手段，同时要加强生物安全措施、注重后备猪的选择、加强定期监测工作，采取综合防控才能使我国伪狂犬病的流行态势得到根本好转。

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M]. 5版.北京：中国农业出版社，2006：218.

[2] 李雄志.猪伪狂犬病的诊断与防治[J].中国动物检疫，2002，19（11）：27-27.

[3] 邬苏晓，刘镇明，肖正中，等.浅谈我国猪伪狂犬病的净化[J].中国动物检疫，2004，21（6）：29-30.

[4] 娄高明，费恩阁，宣华，等.PRV闽A株Bam HI片段克隆及其第7片段的鉴定[J]. 中国兽医学报，1996，16（2）： 108-112.

[5] 赵东升，刘有昌，安福生.近年来我国猪伪狂犬病的流行状况和分析[J].今日养猪业，2008（6）： 26-28.

[6] 刘道新，邱伯根，鲁杏华，等.2001-2008年湖南猪群主要疫病流行态势与分析[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会论文集，2009：917-921.

[7] 陈军，何世成，刘道新，等.2001年-2008年湖南省猪伪狂犬病流行情况统计［J］.中国畜牧兽医，2009，36（6）：160-161.

[8] 邱美珍，傅胜才，杜丽飞，等.湖南省部分规模猪场伪狂犬病野毒血清流行病学系统监测与净化分析[J].养猪，2012（3）：89-92.