肝纤维化的动物模型制备研究

王晓丽

(临汾职业技术学院，山西 临汾 041000)

肝纤维化是许多无关损伤病因的慢性肝病的一个典型的结果。它来自生理伤口愈合反应的连续轮回或长期激活，从而维持了持久性纤维形成，最终导致器官的渐进纤维化［1］。为研究肝纤维化，评估治疗方法和策略的抗肝纤维化效果，几十年来动物模型一直都在被使用［2］。该领域(纤维化动力学，基质生成细胞、主要机制和纤维化相关胞内信号通路的识别，基质重塑和纤维化可逆性的概念和机制……)的重大进展都来自动物模型的研究，来自实验结果与临床资料的对比。

1 肝纤维化的体内研究模型

动物模型可进行的研究包括:a)在人类研究中不能被解决的问题而需要复杂而全面的研究;b)在疾病演化与回归的关键时刻进行多次采样;c)实验测试的变量数可以保证科学试验要求的最低限度。与体外模型相反，整个器官是完整的(不同类型的细胞和基质之间的相互作用)，也是一个活体的一部分，神经、内分泌、神经内分泌、循环系统、饮食、肠源性等等，这些因素的影响也能得到兼顾［2］。

动物模型的缺点是在动物身上复制人类疾病，他们在免疫反应、基因表达/调控、代谢、药理或组织反应等方面与人体有大的种属差异［3］。在动物模型中的纤维化诱导刺激的选择根据的是研究者的想法，期望与动物反应相联系起来的发病机制能够类似于那些发生在人类相关疾病的机制。这种想法在某种情况下可能是自欺欺人、一厢情愿的。为人类疾病提供一个完美的模拟、涉及相同的致病因素和病理生物学过程(包括免疫/炎症反应)，病理和疾病重现性达到与人体相同的结果，这对于任何动物模型而言，几乎不可能。因此，把在动物模型观察到的结果应用到临床上时必须格外小心。

虽然动物模型对理解病理生理过程具有巨大的价值，但他们是模型的本质没有发生改变，他们不能重复再现真正的人类疾病。所以说，每一个模型(包含目标、设计、株系和物种)显示纤维化的发病机制、局部解剖和演化都有自己独特的特点。在使用一个动物模型之前，首先必须考虑的一般概念，如可重复性(一个通用时间框架内，动物部分达到预期的状态)，特异性(即模型应该具有所需的异常，没有任何其他的并发症，如果这样的并发症确实存在，它必须具有典型性和可重复性)和可行性(实验室是否具备相应的专业知识、人力、设备、经特定训练的从事模型构建或处理的人员)。纤维化发生被激活，但纤维化的特异性触发与调控机制是取决于动物实验所需的模型、设计、物种和品系，而事实上的确如此，不同的动物模型，其纤维化的模式大不相同。

纤维化模型首先在大鼠被开发，后来因为小鼠遗传学的优势而采用小鼠。在实验中当大小是一个问题时，例如实验需要进行成像技术或血流动力学测量时，大鼠可能会占有一定的优点。在一些研究中，狒狒和黑猩猩已被分别用来研究酒精诱导和病毒性肝炎。

在测试一个潜在的抗纤维化剂的功效研究中，一般认为药物应在至少两个动物模型中进行［4］。关于使用这些模型的一个至关重要的问题是，它们的使用应注意匹配潜在抗纤维化剂的作用模式。在选择可用的治疗模型时，应该首先考虑人群中肝损伤的起始病因。当肝损伤的起始病因不能被处理和/或纤维化进展为肝硬化时，使用动物模型必须确保抗纤维化剂不影响用来产生肝脏损伤的实验剂的肝毒性，也就是说，如果使用四氯化碳肝纤维化模型，该抗纤维化剂不能是一个CYP2E 的抑制剂［5］。否则纤维化的减少可与肝脏损害的水平降低有关，而不是由于抗纤维化剂的作用。

在肝纤维化的基本机制和测试新的抗肝纤维化药物研究中，以前开发的各种动物模型已经发挥了重要功能［6］，但必须认识到，与人的“对应体”相比，它们都表现出一定的显著的形态差异。至少胆汁淤积模型是这样，特别是常见的胆管结扎，其纤维化的图式与人的胆汁流动中断的症状是非常相似的。另一方面，常用的四氯化碳模型可能是研究纤维化和肝硬化回归的最常用工具，但与大多数人类肝硬化相比，症状中的纤维隔却很少能在动物中观察到，即使在长期的四氯化碳诱导下，也是如此。人类和动物模型疾病之间最重要的区别之一可能是后者缺乏血管相关的显著改变，人类的肝硬化往往是通过二次缺氧事件掺入了肝细胞的损失，导致肝实质结构的消失。这个现象不会发生在常用的动物模型中。

2 肝纤维化的体外模型研究

至目前为止，虽然抗肝纤维化药物研究的发展主要依靠体内动物实验，但是体外模型在研究肝纤维化发展中所涉及的机制方面则更具有优势［3］。实验动物模型一个重要的缺陷在于这些模型在很大程度上仅限于啮齿类动物，由于种间差异，这些模型提供的人类疾病和药物毒性导致纤维化的预测值可能是有限的。另外，从动物伦理角度出发，纤维化的体内模型给实验动物造成很大的伤害，因此，应尽可能地避免使用动物。体外模型的主要优点在于它是使用人体细胞或组织，可以解决物种的差异，其结果与人的疾病机理能有更高的相关性。

肝脏中纤维化的发展是一个多细胞过程，意味着不同的细胞类型涉及这个结果。肝脏中参与肝纤维化发展的许多类型的细胞已经得到确认［7］。简单地说，受损的肝细胞(主要是受损的肝实质细胞)，产生多种介质，如活性氧和促纤维化细胞因子，启动肝星状细胞(HSC)和/或其他促纤维化细胞的活化和增殖，生产过量的细胞外基质(ECM)［8］。ECM 沉积增加主要原因是活化的HSC 生产基质蛋白的增加。ECM 积聚及其蛋白质组成的深刻变化，反过来又可以进一步促进HSC 的活化和增殖，从而加剧纤维化的进展［7］。

如上所述，在细胞水平上，肝星状细胞被认为是肝纤维化发展中的关键角色。因此，体外肝纤维化模型中最常用的是静态肝星状细胞的分离及其在塑料培养皿含血清培养基中的培养。在这些条件下，细胞开始一个表型转分化的过程，该过程与响应于慢性肝损伤的肝脏中出现活化肌成纤维细胞表型的过程类似，特别是当培养基中存在Kupffer 细胞时(作为次要的杂质)［9］。一旦细胞激活为肌成纤维细胞的表型，细胞在随后的传代中仍保持肌成纤维细胞表型。在可能的情况下，细胞检查应在原初代培养中使用，因为这期间是唯一来检查转分化的影响时间。

需要注意的是，实验室方案的差异可能会导致在肝肌成纤维细胞性质的差异，或肝星状细胞衍生的肌成纤维细胞可能会被汇管区肌成纤维细胞的生长所代替［8］。而且目前没有静态肝星状细胞群的公认诊断标志物，可用于确认细胞的特性和纯度。尽管如此，体外培养系统将仍然是一个宝贵的工具，用于研究肝纤维化，可以很容易地用于高通量筛选实验来检测潜在的抗纤维化药物。

一个技术上更具挑战性的体外模型是肝脏切片的培养［10，11］。从正常或病变的肝脏得到的肝片将保留其原生的细胞外基质、细胞与细胞的接触和细胞密度，这是一个有价值用于短期研究的模型。然而，即使是最薄的组织切片(约200 μm厚，10 个细胞厚)要保证营养能够有效地到达薄片组织的大部分细胞，特别是肝细胞，也是很难的，所以一般在培养24 h 后死亡［12，13］。

啮齿动物来源的肝星状细胞很容易地培养许多代，因此，如果只是研究促纤维化状态的肌纤维母细胞，永生细胞株往往不是必需的。要研究自静止状态开始的转分化过程，细胞需要反复从动物中分离，因为肌成纤维细胞不容易恢复到静止状态。啮齿类动物的肝星状细胞株的价值在于它们容易被构建质粒转染。大多数实验室直接进行人体实验很困难，所以使用人肝星状细胞系是比较常见的。此外，大多数人的肌成纤维细胞传代培养2 ～5 代后，便出现衰老(58 份来自人的培养样品，只有2 份样品能够传代培养5 代以上)。部分原因可能是分离的细胞主要来自老年患者(主要是从患有肝脏继发性肿瘤的患者得到的部分肝切除标本)。

人类肌成纤维细胞对转染也有一定抵抗，对于一系列报告基因的构建质粒，只有核转染才足够有效［14］。病毒载体已被证明在感染细胞方面具有较高的效率，这些载体包括腺病毒［15，16］，逆转录病毒［17］与杆状病毒［18］。虽然报告证实它们是有效的，产生重组载体所需资源的缺乏可能是导致它们难以得到广泛使用的原因。

目前，体外模型系统仍然是一个有效来筛选大量潜在化合药物的方法，尤其是在早期阶段，为药物调节纤维化过程的能力提供各种靶点。然而，很多体外系统也有局限性，这些局限阻碍了对于抗纤维化剂的识别，不能达到100%的准确性。体外系统是一个封闭孤立的人工体系，不能像整体研究一样，可以研究药物的吸收，分布，代谢和排泄。在体内肝肌成纤维细胞紧挨机体的主要药物代谢细胞，但是体外系统缺乏这些。因此，仍需要将体外模型更换为体内动物模型来做进一步的研究，体内动物模型在肝纤维化的研究中发挥着无可替代的作用。

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