猪肺炎支原体致病机理研究进展

李彦伟，刘茂军，武昱孜，张 旭，李桂兰，张 映，邵国青＊

（1.江苏省农业科学院兽医研究所／农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014；2.山西农业大学，山西太谷030801）

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of Swine，MPS）的主要病原。猪支原体肺炎是一种慢性、接触性传染病，具有高发病率和低病死率的特点［1］，主要表现为食欲减退、发热、咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，患病猪生长缓慢，饲料转化率下降，常诱发其他病原的感染，特别是免疫抑制性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV-2），引起免疫抑制诱导，常因同时继发细菌感染引起死亡，是世界上最主要的猪病之一。

Mhp缺乏细胞壁，是一种介于细菌和病毒之间的、最简单且能够自行繁殖的原核生物，自然宿主仅见于猪。通过发病猪的咳嗽、打喷嚏或喘气排出体外。已有研究表明，它是一种黏膜病原体，主要存在于猪气管及支气管中，通过附着于猪气管和支气管上皮组织的纤毛而定植于呼吸道中。Mhp 在呼吸道中的附着可造成纤毛的聚集和上皮细胞的病变或坏死，甚至破坏呼吸道黏膜层，使纤毛发生萎缩或脱落，不能有效清除呼吸道中的碎片及侵入的病原菌，导致黏膜纤毛功能的降低，从而引起猪的呼吸道疾病。本病广泛存在于世界各地，持续感染且难以治愈，同时由于感染猪较高的治疗费用并造成生产性能降低，从而给养猪业造成严重危害［2-3］。

1 猪肺炎支原体基因及其结构

目前，已经完成4株猪肺炎支原体的基因组测序，分别是168株、J株、7448型和232型。猪肺炎支原体232 型基因组892 758bp，G＋C 平均含量28.6%，推测有692个CDS（编码序列），编码的蛋白质大小平均约388 个氨基酸。692个CDS 中，304个编码具有功能作用的蛋白（约44%），261个编码保守的假定蛋白，127个编码特征性假定蛋白。其基因组中有一个独立的16S～23SrRNA 操纵子基因，一个5SrRNA，它位于距离23SrRNA 基因100kb处，还有30个tRNA 编码基因。基因组中含有很多基因家族，占总编码序列的26.3%［4］。

在基因组的结构上，猪肺炎支原体中几乎不存在重复序列，但是其黏附因子P97中存在重复序列，同时P97操纵元下游的P102蛋白中也存在重复序列。启动子下游310 bp 处可能编码脂蛋白的mhp288中也存在10.6个重复序列（CTACCCAAAAAGATCAAA）。猪肺炎支原体重复序列的分析结果显示，它的最小长度为25bp，出现频率最高的重复序列是反向互补的［5］。

2 黏附蛋白

由于猪肺炎支原体培养比较困难，培养基成本高，培养耗时长，培养滴度低（大多在107ccu／mL ～108ccu／mL），造成生产成本高，而且制备出的疫苗效力也不理想。许多证据表明，在由支原体引起的疾病中，支原体的黏附在致病机理中起着很重要的作用，几乎所有的人类和动物支原体都是依靠黏附到宿主细胞上，然后在宿主内定植并感染。

因此人们研究猪肺炎支原体的致病机理主要是从黏附蛋白方面入手，而现在研究的最多的是p36、p46、p97、p110等蛋白。研究报道表明，Mhp p36蛋白又叫乳酸脱氢酶（LDH），是细胞溶质蛋白，产生抗体的时间较晚，但其具有种属特异性的抗原决定簇，它的多克隆抗体对相关菌属的p36蛋白并没有交叉反应［6］。p46蛋白是猪肺炎支原体的表面膜蛋白，与其他支原体也无交叉反应，同时又是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白。同源性比较发现，猪肺炎支原体的P46基因在Mhp种内保守，因此常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白［7］。张启敬发现单克隆抗体（MAbF2G5，MAbF1B6）可抑制猪肺炎支原体黏附在猪气管的纤毛上。这两个单抗可以识别p97蛋白，纯化的p97蛋白可结合在纤毛上抑制猪肺炎支原体的黏附，最后证明了97ku的膜蛋白p97为纤毛黏附因子。单克隆抗体MAbF1B6为纤毛阻断抗体，它识别P97基因中的重复序列区R1区，所以说明R1区为p97蛋白中的主要抗原决定区［8］。感染Mhp后，最早产生的抗体是针对p97 的IgA 和IgM，比其他Mhp主要抗原的抗体早30d～60d，因此，最近几年对p97的研究成为制备疫苗的主要抗原。p110蛋白是Chen J R 等用一种抗Mhp的单克隆抗体对猪Mhp 的细胞蛋白进行亲和层析，通过HPLC-GPC分子质量测定得到的一种蛋白，它由一个p54蛋白亚基和2个p28蛋白亚基通过二硫键组成，其中前者是主要抗原蛋白亚基，为糖蛋白。在吸附抑制试验中表明p110是猪Mhp的黏着素蛋白，这是继p97 之后发现的又一种纤毛黏着素蛋白。p110蛋白能够抑制Mhp对纤毛的黏附，与常见的其他支原体、病毒和细菌无交叉反应。Meens J等［9］通过肽点阵列又鉴定出了一个具有高免疫性的猪肺炎支原体膜蛋白Mhp366。

此外，目前发现的猪肺炎支原体膜蛋白还有p116、p216、p271、p107 等。虽然Mhp 与猪呼吸 道纤毛的黏附机制还没有完全证实，但对这些黏附蛋白的研究将有利于其致病机制的研究和疾病的诊断与防治。

3 蛋白组学

自20世纪90年代蛋白质组学技术应用以来，其在肿瘤、肝病、肾病、神经系统疾病等研究领域的应用取得了快速发展，成果显著。近年来，该技术在猪肺炎支原体性疾病研究中开始应用，Li Yuan Zuo等［10］用双向电泳和质谱分析猪肺炎支原体致病性232毒株和无致病性J株，结果显示，在232毒株中黏附蛋白p97、p159和p102大量表达，而J株则更多表达的是糖异生中的3-磷酸甘油醛脱氢酶，及丙酮酸代谢通路中的乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和磷酸乙酰转移酶。Pinto P M 等［11］通过双向荧光差异技术结合免疫印迹和质谱比较了体外培养的非致病的猪肺炎支原体J株和致病的7448 株和7442株，确定了67个表达有差异的蛋白，包括在致病株中过量表达的一些黏附蛋白，通过2DE 免疫印迹鉴定了3株支原体中p97蛋白的不同水解模式，其中猪肺炎支原体基因组中有35%是隐蔽的。在J株中鉴定出81个蛋白，而在另外两个株中鉴定出54个蛋白，这些鉴定出的蛋白可以观察到有一些是重叠的。丰度分析鉴定出来的蛋白表明64个蛋白是过量表达的。Calus D 等［12］应用双向荧光差异凝胶电泳技术（2-D DIGE）研究了高低毒力的mhp分离株，找到了58个差异蛋白点。Cacciotto C 等［13］应用2D DIGE研究了无乳支原体脂溶性蛋白，与无乳链球菌脂溶性蛋白质组2D 图对比，识别出40个独特的蛋白，随后用脂溶性蛋白型菌株PG2和2株野生型株做2D DIGE分析和质谱分析，鉴定出了194 个差异蛋白点。

对于这些鉴定出来的差异蛋白，可以利用生物信息学分析技术和已知基因组序列及其相关数据库资源对这些差异蛋白的功能信息，编码基因信息以及其相关胞内信号通路等信息进行解析注释，建立差异蛋白谱，然后应用Western blot和免疫组织化学等相关技术，来分析和验证这些差异蛋白，最后进行综合分析，从而为猪肺炎支原体致病机理的研究提供帮助。Congli Y 等［14］通过基于凝胶的LC-MS／MS分析猪肺炎支原体的蛋白质组，跨物种Mollicutes蛋白数据库搜索，确定了192个含有2个以上肽链的蛋白，同时还有217个一肽的假定蛋白，通过检索KEGG 数据库确定了碳代谢途径和核酸生物合成中的大部分酶。从而得出猪肺炎支原体的能量可能主要取决于糖代谢。这又为从蛋白组学水平对猪肺炎支原体的研究提供了一个良好的基础。虽然蛋白组学技术发展较为成熟，各领域所取得的成果也较为显著，但是在猪肺炎支原体方面，蛋白组学技术方面主要还是运用双向电泳和双向荧光差异电泳技术进行研究。双向电泳是分析蛋白组学较为经典的技术，但其缺点就是操作步骤繁琐，灵敏度较低，重复性较差等，而双向荧光差异电泳技术可以弥补这些缺点，但其分辨率还是很低。近几年又发展起来的iTRAQ 技术，则具有高敏感，标记效率高，重复性好，定性和定量同时进行等优势，这一技术已经在猪圆环病毒感染细胞中应用［15］，但是在猪肺炎支原体研究中尚未见到报道。

4 细胞炎性因子

猪肺炎支原体介导的复杂，慢性的呼吸道疾病与呼吸系统免疫应答反应的改变或调节有关。虽然目前猪肺炎支原体诱导免疫反应和疾病相关炎症反应的发生机制还不清楚，但是免疫病理学上的改变是猪肺炎支原体的一个重要组成部分。光镜下，猪支原体肺炎的特征性病理变化为细支气管周围和血管周围有巨噬细胞和淋巴细胞等单核细胞浸润，随着病程延长，B淋巴细胞和T 淋巴细胞的浸润将会促进类胚中心淋巴小结的形成。

猪肺炎支原体感染引起的单核细胞浸润对机体的两大免疫有影响，包括来源于先天免疫系统的巨噬细胞和获得性免疫系统的B 淋巴细胞和T 淋巴细胞。Tajima等通过证实切除胸腺的猪用抗胸腺血清处理后接种猪肺炎支原体所引起的肺炎较轻，从而进一步证实了免疫系统在猪支原体肺炎致病机理中的作用。这些结果表明一个由细胞介导的免疫机制在肺炎的发展中可能有非常重要的作用［2］。

2004年Rodriguez F等通过免疫组织化学技术检测自然感染猪肺炎支原体。在支气管和淋巴组织的增生细胞中发现了炎性因子和调节因子（特别是IL-2、IL-4和TNF-α，局部检测到IL-1（α，β）和IL-6）。在感染猪的支气管肺泡中检测到IL-1β、TNF-α，肺泡隔的单核细胞中检测到IL-6、IL-8。Choi C等在感染猪肺炎支原体35d后的猪肺病样中，通过RT-PCR、形态学分析及原位杂交检测到IL-1、TNF-α和IL-6这3个细胞因子的表达。刘朋军［16］在探讨猪肺炎支原体对免疫细胞因子IL-1β的影响试验中，用ELISA 检测白细胞介素（IL-1β）在攻毒后7、14、21d后的含量，结果表明，攻毒组在3个时间点血清IL-1β含量都高于空白对照组。方晓敏等［17］通过PCR-SSCP技术检测实验猪群TLR2、TLR4基因SNPs分布，对其中部分SNP 不同基因型猪的肺部巨噬细胞做LPS 感染试验，借助RTPCR 跟踪不同时间点猪TLR2、TLR4 基因及促炎性因子TNF-α、IL-1β的表达变化，从而发现LPS诱导下的猪肺部巨噬细胞促炎性因子TNF-α、IL-1β均表现不同程度的表达上调。Woolley L K 等［18］在研究感染猪肺炎支原体的猪呼吸道中纤维蛋白溶酶的活性时发现，纤维蛋白溶酶在感染猪肺炎支原体后活性增强，并且与促炎性因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的水平呈正相关。Marchioro S B等［19］在研究肌肉注射猪肺炎支原体灭活疫苗的试验中发现，对试验58d安乐死的猪，接种猪中IL-10和IL-12的分泌都显著高于未接种猪，同时在接种猪的肺泡灌洗液中也检测到IgG、IgM 和IgA。

更多的研究表明，在猪肺炎支原体感染中，巨噬细胞和淋巴细胞的激活导致一些细胞炎性因子的表达，在猪支气管肺泡管分泌液中，炎性因子也会增多，产生的炎性因子加剧了肺胀的炎症反应，进而降低呼吸免疫系统控制呼吸道内其他病原菌的能力。虽然炎症反应在控制病原微生物感染中起到很重要的作用，但是猪肺炎支原体感染引起的炎症反应更易引起宿主细胞组织的损伤和疾病的发生。

Damte D 等［20］在研究猪肺炎支原体对小鼠 肺泡巨噬细胞的炎症反应中发现，猪肺炎支原体诱导产生了NO，同时也检测到了促炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），免疫印迹分析发现，3 个MAPK 通路，细胞外信号调节激酶Ⅰ／Ⅱ（ERK1／2），P38和JUNN 末端激酶／应激活化蛋白激酶（JNK／SAPK）都参与了此过程。

虽然1993年Asai等研究感染猪肺炎支原体的猪支气管肺泡灌洗液中的促炎性细胞因子时发现，信号通路参与的过程中并不成立，但是对于感染中的巨噬细胞等免疫细胞分泌的免疫因子通常会增加，包括TNF-α、IL-6和IL-1β。

炎性细胞因子是一类主要由免疫系统细胞生成的具有许多强大生物学效应的内源性多肽，可介导多种免疫反应在发生病毒感染时，炎性因子的研究对于免疫应答的研究至关重要，同时能够有效的评价免疫效果。因此，对炎性因子的研究已成为病毒感染试验中一个关键性检测指标。例如Silva-Campa E等［21］在猪繁殖与呼吸综合症病毒对调节性T细胞的分析中发现，PRRSV 感染诱导产生了CD4＋CD8＋CD25＋Foxp3high 表型的T 细胞和TGF-β。Barranco I等［22］在研究猪感染PRRSV 后，淋巴结中的IL-12、IL-10、IFN-α、IFN-γ 的表达时发现，感染第3天，在淋巴结中就可以分析到IL-12、IFN-α、IFN-γ的表达，而IL-10的表达量却低一些，这很可能是包括IL-10表达在内的其他机制在诱导产生一个不稳定的宿主免疫反应中起一定的作用。Borghetti P等［23］研究猪圆环病毒2 型（PVC-2）感染接种疫苗和未接种疫苗的两组猪外周血单核细胞（PBMC）中的促炎性因子和免疫细胞因子，发现接种疫苗组的猪中，早期就可以检测出大量的IL-8、TNF-α、IL-1β和IFN-γ。在病毒感染过程中，一些促炎性因子的表达有希望作为早期感染和先天性炎症反应效率的标记。

当病毒感染宿主时，机体的免疫系统被激活进而产生炎性因子。这些因子在先天性免疫和获得性免疫系统阻止病原的入侵和复制过程中起关键性作用，同时能够促进组织对病原和被感染细胞的清除。但是，如果产生的细胞因子较少，免疫应答的发生将会被推迟，不能有效的清除病原。

5 展望

猪支原体肺炎在世界范围内广泛存在，一旦在猪场感染便难以控制，每年给我国的养猪业造成百亿元以上的经济损失。猪肺炎支原体不仅是猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要病原之一，而且它常诱发其他猪免疫抑制性疾病的发生。单纯感染猪肺炎支原体时常引起温和型慢性肺炎；然而，当与其他病原混合感染时，呼吸道疾病加重，引起猪呼吸道疾病综合征。大量研究已表明猪肺炎支原体与其他病原体具有协同感染的作用。大多数情况下，协同猪肺炎支原体感染的病原体能增加相关疾病的严重性和潜在的持久性［24］。

疫苗免疫是预防该病的最有效手段。但目前的疫苗都不能清除和抵御猪肺炎支原体的感染，仅能减少其感染后引起的损伤。在免疫后，Mhp仍可在猪呼吸道长期定殖，这说明猪肺炎支原体在感染中存在许多未知的机制，而猪肺炎支原体致病机制的研究是对该病进行早期诊断、免疫预防及净化的根本基础。因此，该病防控的根本出路在于对其致病机制的研究。

随着对猪肺炎支原体致病机理研究的不断深入，必将对猪支原体肺炎的防控和诊断起到积极的作用。结合当前实际情况我们今后研究工作的方向是：一方面要继续加大基础研究的科研投入，继续研究和发现猪肺炎支原体的各种毒力因子，并揭示病原的致病因子；另一方面要从宿主与病原的相互作用出发，通过分子病理学、分子免疫学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等多方面来共同进行研究。只有这样才能更加全面准确的解决和揭示猪肺炎支原体的致病机理，才能对猪支原体肺炎的防控起到积极的作用。

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