山药饮片中多糖、尿囊素的含量测定研究

★ 王文 胡鹏翼

（1.江西省皮肤病专科医院 南昌 330001；2.江西中医学院 南昌 330004；3.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

山药为薯蓣科多年生宿根蔓草植物山药（拉丁名为Dioscorea opposita Thunb）的块茎，又名白茹、土薯、大薯、薯药，具有补脾、益肺、固肾、益精的作用，原名薯蓣，首见于《神农本草经》，列为上品[1]。山药主产于河南、广东、广西等省亦广泛栽培，以河南焦作市（古怀庆府）所产“怀山药”最佳。《本草纲目》记载其能“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涏，润皮毛”，现代医学研究表明，山药具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗突变和肝损伤保护等多种生物活性，主治脾虚泄泻，久痢，虚劳咳嗽，遗精带下，小便频数，消渴，子宫脱垂。具有益气补脾、滋补作用、能助消化、补虚劳益气力，并有缓泻祛痰等作用。山药多糖是被公认的重要活性成分之一，本文对山药饮片中多糖进行提取精制，并采用硫酸-苯酚显色法[2]进行含量测定。山药中的尿囊素（allantoin）具有生肌作用，被广泛用于医药、日化、轻工以及生物工程等领域，为山药主要活性成分之一，与其功效密切相关，在山药中含量较高，常作为有效成分评价山药的质量，因此本文也对山药中尿囊素进行含量测定。

1 仪器、试剂、材料

1.1 仪器

ΜV2550紫外分光光度计（岛津）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；BSA223S sartoris分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KDM型控温电热套（鄄城华鲁电热仪器有限公司）；KQ-300E型超声清洗器（昆山市超声仪器有公司）；XW-80A旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；B-490 BUCHI旋转蒸发仪（厦门精艺兴业有限公司）；Megafuge 1.0R离心机（德国Thermo公司）

1.2 试剂

硫酸（西陇化工股份有限公司）；苯酚（西陇化工股份有限公司）；无水乙醇（上海振兴化工一厂）；氯仿（国药集团化学试剂有限公司）；正丁醇（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 材料

铁棍山药（河南省温县康之源怀药有限公司）；山药饮片（江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，批号1109008，产地河南）；D-无水葡萄糖标准品（中国药品生物制品检定所，110833-200904）；尿囊素标准品（中国药品生物制品鉴定所，批号为11501-200202）。

2 方法与结果

2.1 山药多糖的提取[3]

将山药饮片按重量比为1：9比例加入蒸馏水，热回流3次，每次2h，合并3次提取液，放冷后过滤，滤液60℃旋转蒸发浓缩，浓缩液加入Sevage试剂（V氯仿：V正丁醇=4：1），混合后剧烈振摇20min，然后再4 000r/min离心10min，弃去下层有机相以及中间层凝聚物，收集上清液，重复1次。取已脱蛋白的上清液加入95%乙醇至乙醇浓度为80%，可见大量的白色絮状沉淀析出，4℃冷藏过夜，收集沉淀，沉淀用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤多次后，50℃真空干燥即得山药多糖。

2.2 山药中尿囊素的提取

精密称取山药饮片粉末0.25g置25mL容量瓶中，加入20%甲醇溶解稀释至刻度，超声0.5h，0.45μm微孔滤膜过滤即为山药饮片供试品溶液。

2.3 山药多糖的含量测定

2.3.1 检测波长的选择：取葡萄糖溶液0.4mL，加双蒸水到2.0mL，再加质量分数为6%苯酚溶液1.0mL，用涡旋仪器混匀，迅速加入浓硫酸5.0mL，再涡旋使之均匀，放置5min后，置沸水浴中加热15min，取出迅速放在冰水中冷却至室温；另以双蒸水2.0mL，加苯酚和浓硫酸，同上操作做为空白对照，在300-750nm波长范围扫描，结果最大吸收波长为488.7nm，因此选择489nm作为山药多糖的含量测定波长。

2.3.2 标准曲线的制备：称取吸取D-无水葡萄糖标准品9.99mg置于100mL的容量瓶中，加双蒸水溶解稀释到刻度，得到浓度为99.9μg/mL溶液。取99.9μg/mL D-葡萄糖标准液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0分置于10mL具塞试管中，各加双蒸水到2.0mL，再加质量分数为6%苯酚溶液1.0mL，用涡旋仪器混匀，迅速加入浓硫酸5.0mL，再涡旋使之均匀，放置5min后，置沸水浴中加热15min，取出迅速放在冰水中冷却至室温；另以双蒸水2.0mL，加苯酚和浓硫酸，同上操作做为空白对照，在最大吸收波长（489nm）处测定吸光度值，结果由吸光度值（A）对溶液浓度（C）线性回归，得回归方程Y=0.0525X+0.0989，r=0.9993，葡萄糖在2.5-12.49μg/mL范围内呈线性。

2.3.3 回收率的测定 精密量取已知含量的样品0.5mL，精密加入D-无水葡萄糖标液（99.9μg/mL）各0.20、0.25、0.3mL，加水至2mL，加6%苯酚1mL，涡旋混匀，迅速加浓硫酸5.0mL，涡旋混匀后放置5min，沸水浴15min，迅速放入冷水中，冷却至室温，489nm波长处测定吸光度，计算回收率。结果实验测得平均回收率为98.95%，RSD为3.14%（n=9）。

2.3.4 精密度：取已知含量的样品溶液连续测定5次，按吸光度计算RSD为0.15%。

2.3.5 稳定性试验：取样品按含量测定方法，每隔20min测1次，在2h内溶液稳定，RSD为0.55%。

2.3.6 山药多糖含量测定：精确称取山药多糖10mg，置100mL容量瓶中，蒸馏水超声溶解稀释至刻度，取2mL于具塞刻度试管中，再加质量分数为6%苯酚溶液1.0mL，用涡旋仪器混匀，迅速加入浓硫酸5.0mL，再涡旋使之均匀，放置5min后，置沸水浴中加热15min，取出迅速放在冰水中冷却至室温；另以双蒸水2.0mL，加苯酚和浓硫酸，同上操作做为空白对照，在最大吸收波长（489nm）处测定吸光度值，计算含量，结果山药多糖含量为0.61%，RSD为1.05%。

2.4 山药尿囊素的含量测定

2.4.1 色谱条件[4]：phenomenex Luna C18色谱柱（4.6mm×250 mm，5μm）；流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～10min，A为5% ～10%）；流速0.5mL/min；检测波长为224nm；柱温为30℃，进样量20μL。2.4.2标准曲线的制备：精密称取尿囊素对照品5.10mg置25mL容量瓶中，加90%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，浓度为204g/mL，依次量取该溶液0.25、1、2、3、4mL至5mL容量瓶中，90%甲醇稀释至刻度，摇匀后分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图，并以浓度（C）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程A=11.266C-7.7057，r=0.9991，可见尿囊素在10.2-163.2g/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.4.3 回收率：精密称取尿囊素对照适量，加到已知含量样品中，按供试品溶液制备方法制备待测液。精密吸取20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算样品中的尿囊素的含量，结果回收率的平均值为100.02%，RSD为3.28%（n=6）。

2.4.4 精密度试验：取已知含量的样品溶液连续测定5次，测定峰面积，结果RSD=1.12%。

2.4.5 稳定性试验：在4h内考擦样品稳定性。精密称取山药饮片，按供试品制备方法制备待测溶液，精密吸取20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。结果RSD=1.28%，表明溶液在8h内稳定。

2.4.6 样品含量测定：按“2.2”项制备样品溶液，精密吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入线性方程计算样品中的尿囊素的含量，结果含量为0.58%，RSD为0.89%。

3 讨论

紫外-可见分光光度法是目前测定多糖含量最常用的方法，常用的显色剂有苯酚，蒽酮-硫酸和3，5-二硝基水杨酸（DNS）。前两者主要利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后与酚类或者胺类反应缩合，生成有特定吸收波长的有色物质进行测定；DNS法则是利用了多糖的还原性。目前最常用的为苯酚硫酸法，本文建立的硫酸-苯酚法测定山药多糖含量，具有精密度良好，重现性强、方便快捷的特点，多糖在2.5-12.49μg/mL范围内线性关系良好，回收率高，能准确快速地进行含量测定。

本文根据文献，在经典苯酚硫酸法基础上，采用体积分数80%乙醇溶液热提以除去单糖、低聚糖、甙类及生物碱等干扰成分，Sevage法脱蛋白，获得比较纯净的山药多糖，测得饮片中多糖含量为0.61%，提取后的山药水溶性多糖的进一步纯化和生物活性功能尚待进一步研究。

近年来，对山药药材尿囊素含量测定方法研究报道较多，其中HPLC法为测定山药尿囊素含量常用的分析方法，本文建立的HPLC方法，测定山药中尿囊素的含量，该法精密度高、操作简便、准确可靠，为山药的全面质量控制提供了参考。

[1]张红英，赵现敏，崔保安.山药多糖研究进展[J].河南中医学院学报.2006，21（127）：87.

[2]徐光域，颜军，郭晓强，等.硫酸-苯酚定糖法的改进与初步应用[J].食品科学，2005（8）：342-345.

[3]孙锋，谷文英，丁霄霖.山药粗多糖的提取工艺[J].食品与生物技术学报，2006，25（3）：79-83.

[4]黄玉仙，易骏，昊岩斌，等.不同山药种质资源的尿囊素含量比较研究[J].福建中医药，2011，42（2）：50-52.