乙型脑炎核酸疫苗的研究进展

王 凤，汤德元*，曾智勇，马 萍，李春燕，刘 霞，徐 健

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025，2、贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008）

乙型脑炎(Japanese encephalitis virus，JEV)，是由乙型脑炎病毒引起的传染性疾病。该病对养猪业造成严重危害，尤其是近年来集约化养猪业发达的国家损失最为严重。虽然兽医科研人员和养猪业者进行多方面的努力，采取了包括种源控制、疫病净化、消毒隔离和早期断奶等防治措施，但仍不能禁绝该病的发生和蔓延。目前预防乙型脑炎病毒感染的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗，但由于灭活疫苗存在注射剂量大，需多次注射，效果不稳定、免疫力不持久及副作用大等不足之处；我国研制的SA14-14-2株减毒活疫苗虽然保护性好，可以很好地刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，但活疫苗毕竟是一种活的微生物，有可能出现毒力反强、带毒、排毒、垂直传播、核酸重组等现象，而且通过常规的血清学方法一般与自然感染无法区分。因此，人们在设法利用生物技术开发新型基因工程疫苗即核酸疫苗以克服现有疫苗的缺点，是当前研究的热点，现将其进行如下综述。

1 乙型脑炎病毒的基因结构及其核酸疫苗候选基因的选择

1.1 乙型脑炎病毒的基因结构

JEV为单股正链RNA病毒，全长约11kb，整个基因组由5′端非编码区(5′-NCR)和1个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框(ORF)和3′端非编码区( 3′-NCR)构成。编码3个结构蛋白：C蛋白(衣壳蛋白)、PrM/M(膜前体蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)以及7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，各基因在基因组上的排列顺序为：5′ -C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。

1.2 乙型脑炎病毒核酸疫苗候选基因的选择

PrM蛋白是未成熟病毒体的一部分，在病毒感染后期，它在被水解为M蛋白后而发育为成熟的病毒体。PrM蛋白存在感染细胞内未成熟的病毒粒子中，在JEV感染的最后阶段，水解成M蛋白。然而，在有些情况下，PrM的剪切可能不完全，结果使PrM蛋白成为毒粒上能产生中和抗体的附加靶位，免疫含PrM/E的胞外颗粒可产生中和抗体和保护性免疫；表达PrM蛋白或E蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠和猪，可有效保护JEV的攻击[1]。而且，JEV糖蛋白容易分泌和表达在细胞表面，这些是其作为有效免疫原的重要决定因素。M蛋白是完全疏水的，参与病毒囊膜的构成，是病毒囊膜主要结构成分之一，被包埋在囊膜的脂质双层中，它可能与插入脂双层的E蛋白完全疏水性C端相互作用，对维持E蛋白空间结构是必需的。Takegami等(1982)对其生物学功能进行了研究，认为M蛋白参与病毒的感染过程，PrM蛋白是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分，M蛋白能诱生具有轻度中和作用的抗体。

E蛋白全长由500个氨基酸残基组成，分子质量约为53 kD，富含Gly和Ala，Pro含量低，是疏水性的，仅有一的糖基化位点在多数黄病毒中具有保守性。E蛋白含有病毒血凝素和中和抗原决定簇，为黄病毒属中的主要结构蛋白，是主要抗原成分，在诱导机体产生有效的中和抗体及保护性免疫中起重要作用[2]。此外，E蛋白还与细胞膜受体相结合并与细胞膜融合而使病毒进入细胞，与病毒的吸附、穿入、致病性、组织嗜性、血凝反应、血清特异性和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。E蛋白上相关位点的氨基酸变异，对JEV神经毒力及神经侵袭力有着重要的影响。另外，JEVE蛋白还是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白，由它形成表面抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。

NS1蛋白是一种分泌型糖蛋自，其分子质量为40kD，但由于在130位和207位存在N-连接糖链，在感染细胞内其实际分子质量为46 kD左右。Mason等(1989)用E.coli来表达JEV抗原，证实在JEV感染的细胞中NS1蛋白以NS1和NS1′2种形式存在，NS1和NS1′在N末端具有相同的序列，NS1′在C末端还存在一段高度疏水的氨基酸序列，该段序列由基因组的NS2a基因编码。NS1分子质量约40kD，NS1′为58 kD。由于NS1和NS1′存在相同的N末端，故有相同的抗原性和生化特性，NS1′是主要的病毒产物，而不是在NS1产生过程中短暂存在的。在细胞培养液中NS1的量大，可能是因为NS1比NS1′更有效地分泌到细胞外或NS1′在释放过程中被降解为NS1。NS1蛋白特异性免疫探针与JEV感染细胞结合的结果说明，其分泌于感染细胞表面。另外，感染细胞还分泌可溶性的NS1。在NS1′C末端存在一段高度疏水的氨基酸序列，使NS1蛋白存在于细胞表面成为可能。Mason等在TritionX-100存在的情况下通过超速离心发现，NS1蛋白的沉降特征发生了改变，说明NSl蛋白与膜相互作用结合在一起。NS1在感染细胞的表面表达，细胞外分泌，不但在黄病毒的感染过程中可引起免疫性反应，而且这种抗体在实验动物体内可起保护作用，这个保护作用依赖抗体的Fc部分，因为NS1专一性抗体通过补体依赖途径杀伤感染的靶细胞[3]。NS1蛋白不组成毒粒，没有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性补体结合活性，它可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力，且不产生抗体依赖性增强，加之NS1的基因和表型具有高度同源性。有学者认为黄病毒NS1作为亚单位疫苗比灭活疫苗有优势[4]。

2 乙型脑炎病毒核酸疫苗研究进展

2.1 有关PrM、E基因核酸疫苗的研究

Ashok MS等[5]构建了编码JEVE蛋白的DNA质粒PCMXENV，经鼻腔和肌肉途径接种瑞士小鼠后，进行JEV脑内接种攻击试验，结果显示：该重组质粒对攻击感染有一定的保护作用，免疫鼠血清中未能检出抗JEV抗体，但产生了低水平的JEV特异性T细胞增殖。后来其又将E蛋白的全长基因序列和氨基端398个氨基酸的基因序列分别克隆到表达载体发现：只有后者能产生分泌性表达；而且与其他DNA疫苗比较，后者可诱导Th1和Th2的增殖反应，在小鼠能产生最高水平(71%)的抗攻击保护。E基因全长DNA疫苗在小鼠体内只能诱导低水平的中和抗体，认为保护作用可能主要与细胞免疫有关[6]。

Konishi等 (1998)以 pcDNA3.1为载体构建了含JEV中山株前膜信号肽(S)、PrM、E基因cDNA的重组质粒pcDNA3.1JEME，将此质粒100μg肌注小鼠，间隔2周再注100μg，2～3周之后采血测定中和抗体，滴度为1∶640，用P3株l04ID50腹腔攻击，100%(5/5)存活，若用10pg质粒，中和抗体为1∶320，存活率100%，免疫持久性至少为6个月。

Chang等[7]构件了表达PrM和E蛋白的质粒DNA，由巨细胞病毒立即早期基因启动子控制，将该质粒导入COS-1细胞，COS-1细胞向培养液中分泌细胞外病毒样颗粒，用这种DNA疫苗免疫雌性小鼠，产生中和抗体滴度在1∶20到1∶160之间，用5 000 PFU强毒株SA14腹腔注射攻毒，对其子代的保护率在40%到100%之间。免疫7周龄的成年小鼠，3 d后用5 000 PUF强毒株SA14攻毒，小鼠得到完全保护。Chang等的研究表明，所有接种1次JEV DNA疫苗的小鼠体内可产生JEV特异性的抗体，且至少维持18个月。3周龄小鼠免疫后100%血清抗体阳转，中和抗体效价达1∶20～1∶160。获得100%的动物保护。

Chen(1999)等利用真核表达载体分别重组构建了JEVE蛋白以及其他蛋白基因片段，通过比较上述重组质粒在分别免疫动物后所产生的中和抗体效价与保护性免疫效果，发现含JEV E蛋白编码基因的质粒DNA所致的中和抗体效价以及保护性免疫结果明显优于其他蛋白基因片段，用编码JEV E蛋白的质粒免疫小鼠，与灭活疫苗比较，结果产生了更持久和更强的JEVE蛋白特异性抗体，且对JEV的致死攻击具有高度保护作用。

Konishi等[8]构建了2株基于PrM和E基因的DNA疫苗，并进行了免疫试验。结果表明以100～450 μg剂量间隔3周对猪进行二次免疫，免疫后第1周即产生HI抗体和中和抗体，并可维持245 d的高滴度HI抗体水平。试验还证明当以PrM/E质粒DNA疫苗免疫小鼠后，取其脾细胞在体外刺激后可检测出CTL活性，而血清中未能检测出中和抗体。但当小鼠接受JEV攻击后，由于DNA免疫小鼠存在记忆性B细胞和T辅助细胞，中和抗体的滴度迅速上升，并足以保护小鼠抵抗JEV的攻击。他们认为这也许是免疫动物获得保护的机制。Konishi等还发现含病毒PrM与E蛋白编码基因的重组质粒DNA在免疫动物后不仅诱导出特异性的CTL细胞参与细胞免疫反应，而且可产生特异性B细胞参与体液免疫反应，进一步研究还发现在免疫动物体内产生的中和抗体的效价与所维持时间都明显高于普通灭活疫苗的免疫结果，说明了DNA疫苗在预防JEV感染方面的试验研究的可行性。

据报道，基因枪免疫所需的DNA量仅为肌注免疫所需量的1/100～1/200，就可获得相近的抗体反应。Chen等的研究结果不但证实这一结论，而且认为不同的DNA免疫途径产生的抗体亚型和亲和力也不同。

Kaur R等[9]用合成分泌型或膜锚定型JEV的PrM和E蛋白的质粒经肌注或基因枪接种小鼠发现：E蛋白的2种表达类型均能诱导较高的中和抗体滴度，而肌注较基因枪方法能诱导更高水平的抗E抗体反应；认为肌注可能诱导以Th1为主的免疫反应，而基因枪接种诱导Th2为主的免疫反应；在小鼠对JEV脑内接种的攻击感染可提供60%的保护。

Mohammad[10]等以小鼠作为模型，用抗原提呈细胞和巨细胞病毒对JEVE蛋白的表达进行免疫调节，并采用免疫荧光法和Western印迹检测，结果抗原提呈细胞和巨细胞病毒都能刺激小鼠产生的抗体滴度增加，但是巨细胞病毒刺激小鼠产生的抗体滴度更高。更重要的是，由原提呈细胞启动执导的免疫反应偏向Th1型。

prM基因和E基因，分别在N-15和N-154的位置有一个潜在的N-糖基化位点，Yu Zhang等分别在prM基因和E基因的N-连接糖基化位点进行突变处理来构建DNA疫苗，该DNA疫苗免疫小鼠的结果表明，E基因N-154糖基化位点突变的DNA疫苗能使小鼠分泌IL-4的水平升高和产生更大滴度IgG，获得完全保护。因此，E蛋白N-154糖基化位点突变能增强诱导体液免疫应答，表明这种突变可作为针对乙脑潜在的DNA疫苗。

2.2 有关NS1基因核酸疫苗的研究

Lin等用编码JEV PrM/E、NS1基因的质粒DNA皮下接种小鼠，结果发现，编码PrM/E蛋白的质粒DNA免疫小鼠攻击强毒后有70%的小鼠受保护，而用编码NS1的质粒免疫小鼠，强毒攻击后可获得90%的保护。NS1质粒免疫的小鼠虽未检测到中和抗体，但对乙脑病毒感染的细胞在补体参与条件下有很强的溶解细胞作用。用C末端多出60个氨基酸的NS1核苷酸序列(NS1′)的质粒免疫小鼠却经不住强毒的攻击。生化分析表明，NS1很容易分泌大量的同型二聚体并表达于细胞表面，NS1′却不能，且NS2a会下调NS1基因疫苗的效果。不管是用抗NS1单抗被动免疫，或者是用NS1蛋白主动免疫，均证明黄病毒NS1具有激发保护性免疫的表位，证实NS1足够引发保护性免疫。然而，早期许多学者以痘苗病毒、Sindbis病毒和杆状病毒等重组病毒为载体的研究表明，JEV的NS1只能对宿主产生低水平的保护作用。这种差异可能由于使用不同的表达系统和不同的NS1序列。也有可能是在病毒载体的存在下，NS1只能作为很弱的免疫原或多余的NS2A的一些序列可能是导致NS1不能产生有效免疫保护的原因，这些结果与以往对登革热的研究结果相符，重组痘苗病毒含登革热NS1可完全保护登革热病毒的攻击，但在NS1加上15%的NS2a序列后，就不能获得相似结果。

使用核酸疫苗进行免疫既能消除在活疫苗制备中存在的不必要抗原所致的免疫应答，又不必顾虑感染因子所带来的诸多问题，而且能够诱导广泛的体液与细胞免疫应答，有助于产生高水平保护性免疫[11]。但核酸疫苗效力的好坏也取决于许多因素，如抗原自身的特性、免疫途径、是否使用佐剂或使用佐剂的类型等，所以现在人们对影响核酸疫苗效力的各种因素展开了研究[12]。如果核酸疫苗潜在的安全性和接种方法能够得到解决和改进，将具有很大的开发潜力和应用前景。

[1] 汤德元，王凤，马萍，等.乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究[J]. 畜牧兽医学报，2012，43(8)：1330-1336.

[2] Tang D Y, Liu J, Wang F,et al. Isolation and molecular characterization of Japanese encephalitis virus GZ strain from piglets, China[J].African Journal of Microbiology Research, 2013，7(2)：89-97.

[3] 王凤，汤德元，李春燕，等.日本乙型脑炎病毒NS1基因及其疫苗的研究进展[J].中国动物保健，2012，14(12)：16-19.

[4] 李春燕，汤德元，徐健，等.乙型脑炎的发病机理及毒力致病机理的研究进展[J].中国兽药杂志，2008（4）：41-43，53.

[5] Ashok M S,Rangarajan P N.mmunization with plasmid DNA encoding the envelope glycoprotein of Japanese Encephalitis virus confers significant protection against intracerebral viral challenge without inducing detectable antiviral antibodies [J].Vaccine,1999，Aug20;18(1-2):68-75.

[6] Ashok M S,Rangarajan P N.Protective efficacy of a plasmid DNA encoding Japanese Encephalitis virus envelope protein fused to tissue plasminogen activator signal sequences: studies in a murine intracerebral virus challenge model[J].Vaccine,2002 20(11-12):1563-1570.

[7] Chang G J, Hunt A R, Davis B.A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice [J].Virol, 2000，74(9)：4244-4252.

[8] Konoshi E,Yamaoka M,Kurane l, et al.Japanese encephalitis DNA vaccine candidates expressing premembrane and envelope gene induce virusspecific memory B cells and longlasting antibodies in swine[J].Virology,2000,268(1):49-55.

[9] Kaur R,Sachdeva G,Vrati S. Plasmid DNA immunization against Japanese encephalitis virus: immunogenicity of membrane-anchored and secretory envelope protein [J].Infec Dis,2002,185(1):1-12.

[10] Mohammad F A, Milind M G.Comparison of immune response generated against Japanese encephalitis virus envelope protein expressed by DNA vaccines under macrophage associated versus ubiquitous expression promoters [J].Ahsan and Gore Virology Journal，2011, 382(8):1-11.

[11] Gregoriadis G. Genetic vaccines:strategies for optimization [J]. Pharm Res, 1998, 15:661-670.

[12] 王凤，汤德元，罗险峰，等.日本乙型脑炎病毒贵州分离株NS1基因克隆及表达载体的构建[J]. 黑龙江畜牧兽医，2013（4）：90-93.