牦牛超数排卵技术研究概况

2013-08-15张成福

中国牛业科学 2013年5期

张成福

（西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009）

牦牛（Bos grunniens）是分布于以青藏高原为中心，及其毗邻的高山、亚高山地区的特有牛种［1］，是“世界屋脊”著名的景观牛种，藏语叫雅克，国外通称为yak［2］。牦牛具有耐高寒、耐粗饲、抗逆性强、乳脂率高、肉质好，毛绒品质优等特性，为高原人民提供着乳、肉、皮、毛、绒、役、燃料等生活必需品。牦牛的生长繁殖情况直接决定着牦牛养殖户的经济收入和生活水平。全世界现有牦牛近1 500多万头，在牛家族中仅占1%［3］，其中中国的牦牛数量最多，有1 400多万头，占世界牦牛总数的95%以上［4］，而西藏是我国第二大牦牛产区，有牦牛490多万头［5］，占我国牦牛总数的35%。随着胚胎生物技术的延伸以及发育生物学研究的不断深入，超数排卵、胚胎移植技术为加快育种步伐，纯种扩群提供了有力的技术支持。

超数排卵技术是胚胎移植中最基本而重要的技术之一［6］。超数排卵（superovulation）简称超排，在母畜发情周期中的适当时间注射促性腺激素，使卵巢上有比自然状态下更多的卵泡发育并排卵［7］。Smith和 Engle（1927）首先发现超排现象［8］，Cole和Hart（1930）发现孕马血清可使未成熟的大鼠超排［9］，以此奠定了超排的基础。Casida等在1940年就开始了试验牛的超数排卵，后来Graves等又作了进一步的改进［10］。目前大量使用的超排程序是20世纪80年代初成型并推广使用的。供体牛的超数排卵是获得胚胎的关键环节，其效率的高低是制约胚胎移植技术发展的关键因素，超排效率的高低直接影响胚胎的生产数量和胚胎的生产成本，提高供体牛的超数排卵效率是胚胎移植技术推广过程中需要解决的关键问题，也是降低胚胎生产成本的有效途径。本人在查阅大量相关文献资料的基础上，就牦牛超数排卵技术研究的最新进展进行一下概括性的论述，以供大家商榷。

1 超数排卵的机理

动物在出生前卵巢内就含育大量的原始卵泡，但出生后随着年龄的增长，数量不断减少，在发育过程中大多数卵泡中途闭锁而死亡，只有少数卵泡才能发育成熟而排卵。超数排卵的过程就是应用超过体内正常水平的外源促卵泡激素，使将要闭锁的有腔卵泡发育成熟而排卵［11］。排卵前，卵泡经历着三大变化：①卵母细胞细胞质和细胞核成熟；②卵丘细胞聚合力松解，颗粒细胞各自分离；③卵泡腆变薄、破裂。所有这些变化都是由于LH和FSH的释放量骤增，并达到一定比例时引起。

1.1 排卵的生物化学机制

各种动物血浆中LH的水平在卵泡早期比较平稳，到达中期稍有升高，于排卵之前达到最高峰值。LH峰值出现可以激发卵泡膜中腺苷化酶的活性，导致cAMP增加，由此引起颗粒细胞黄体化，使卵泡内孕酮增加，并激活卵泡中蛋白质分解酵、胶原酶等，这些酶作用于卵泡壁的胶原结构，使其张力下降，膨胀性增加，最后引起排卵。试验表明，LH可以使卵巢上的卵泡全部破裂，但只有配合FSH使用时才能排出成熟的卵子。FSH和LH的最小排卵剂量分别是50μg和5μg，如单独注射LH 10μg或更多些，即可能注射后10h半内排卵，但如剂量少于10μg则卵泡就不发生排卵而黄体化。如单独注射FSH 100μg，则注射后10h半内排卵，如少于100 μg，则不排卵，也不黄体化。这充分说明LH 和FSH两者的协同作用。因此，有人假定LH和FSH混合物称为诱发排卵激素（Ovulation inducing hormone，OIH）。此外，孕酮、PGE2及PGF2α等激素也对排卵起重要作用。如上所述，在排卵过程中卵泡外膜发生水肿致使卵泡膜纤维分解酵增加，使纤维蛋白分解，外膜细胞的聚合力松解，因而使卵泡外膜分离，这些变化是由于排卵前出现LH峰后，雌二醇含量减少而孕酮含量增加，使雌二醇和孕酮比例骤变引起的。当接近排卵时，在促性腺激素的作用下，成熟卵泡的cAMP有明显增加，刺激前列腺素（PG）合成，于是卵泡中PGE2和PGF2α的浓度显著升高。PGE2能增强纤维蛋白分解酶原的产生，从而增加纤维蛋白分解酶的活性，使卵泡膜分解破裂，PGE2还可刺激颗粒细胞合成孕酮及本身黄体化，而PGF2α则能对溶酶体膜起破坏作用，因此，它可促进卵泡顶端上皮细胞溶酶体的破裂，使上皮细胞脱落，顶端形成排卵点，所有这些都为排卵创造条件。因此，目前多数报道认为，排卵是由于酶的作用。通过电镜观察，排卵裂口处的局部溶解是从卵巢表面上皮细胞开始，细胞先增大，胞质内所含各种蛋白分解酶的溶酶体增多，释放的蛋白分解酶进入细胞外间隙，使下面的白膜，卵泡内膜与外膜的结缔组织崩解，致使卵泡壁在酶的作用下发生溶解。

1.2 排卵的神经肌肉机制

近年研究发现，在卵泡壁上存在富含自主神经末稍的平滑肌细胞，主要分布在成熟卵泡的外膜细胞上。在排卵前2～3h，卵巢自发性的收缩频率开始增加，在排卵前后达到高峰。PGF2α具有刺激卵巢平滑肌收缩及使卵巢收缩频率增加的作用。卵巢的收缩导致顶端变薄的卵泡破裂。同时，PGF2α刺激卵泡膜的神经肌肉系统，促进卵母细胞的排出。

2 牦牛超数排卵常用的几种激素

牦牛超数排卵常用的激素主要有三大类：一是刺激卵泡发育的激素：促卵泡素（FSH）、孕马血清促性腺激素（PMSG）；二是刺激排卵的激素：促黄体素（LH）、绒毛膜促性腺激素（HCG）；三是辅助激素：前列腺素（PG）、促排卵素3号（LRH－A3）等。

2.1 刺激卵泡发育的激素

2.1.1 促卵泡素（FSH）促卵泡素是垂体前叶合成和释放的一种糖蛋白激素，是垂体前叶促性腺激素之一。对于雌性哺乳动物能够刺激卵泡细胞增殖分裂，促使卵泡扩展、卵泡生长和成熟，提高颗粒细胞内芳香化酶活性，从而将内膜细胞合成的雄激素转化为雌激素。

2.1.2 孕马血清促性腺激素（PMSG）孕马血清促性腺激素是马属动物在妊娠6～20周、由子宫内膜杯状组织（由绒毛膜滋养层细胞侵入母体子宫内膜构成）合成和分泌的一种糖蛋白激素。云马血清促性腺激素兼具促卵泡素和促黄体素双重生物学作用。

2.2 刺激排卵的激素

2.2.1 促黄体素（LH）促黄体素是由垂体前叶合成和释放的一种糖蛋白激素，是垂体前叶促性腺激素之一。对于雌性哺乳类动物能够激发卵泡内膜细胞类固醇合成酶系的活性，从而将胆固醇转变为雄激素，协同FSH促进卵泡的成熟。排卵前LH高峰引起的母细胞恢复减数分裂，改变颗粒细胞的内分泌功能，导致排卵并形成黄体。LH还具有维持黄体分泌孕酮的作用。

2.2.2 绒毛膜促性腺激素（HCG）绒毛膜促性腺激素是人类（或灵长类动物）在妊娠8～22周由胎盘的合胞体滋养层所合成和分泌的一种糖蛋白激素。这种激素具有促黄体素的生物学作用。

2.3 辅助激素

2.3.1 前列腺素（PG）前列腺素广泛存在于多种器官和组织中，一般是就地产生并就地发挥作用，所以称为局部激素。PG是一种不饱和脂肪酸的衍生物，种类很多，同生殖机能关系密切的主要是E和F两种类型，而在超数排卵中常用的是F型。F型前列腺素（PGF）能够引起功能黄体退化，尤其以前列腺素F2a（PGF2a）的溶黄体作用最为显著。由未孕子宫角的内膜产生，经特殊的子宫－卵巢血管系统进入同侧卵巢，引起黄体退化。

2.3.2 促排卵素3号（LRH－A3）促排卵素3号为人工合成的多肽激素，为丘脑下部释放的促黄体素释放激素的类似物，兼具有促黄体素和促卵泡素作用。能促使动物垂体前叶释放促黄体素（LH）和促卵泡素（FSH），使血浆中LH浓度明显升高（FSH浓度轻度升高）促使卵巢的卵泡成熟而排卵。

3 牦牛超数排卵方法的研究概况

牦牛的超数排卵和胚胎移植研究较其它牛种起步较晚，直到本世纪初才陆续开始。2002年中国农科院兰州畜牧与兽药所［12］首次母牦牛冲卵成功，获得17枚野血牦牛胚胎。同时期，罗晓林［13］曾结合牦牛杂交改良（利用黑白花牛冻精冷配家牦牛）、野牦牛驯化及人工采精、野牦牛改良复壮家牦牛、牦牛体外受技精术的研究，阐述了动物生物技术在牦牛的人工授精、诱导发情、同期发情、超数排卵、胚胎移植、体外受精等方面的应用与发展。截至目前，对牦牛超数排卵方法的研究大致有两大类，即单一激素超排和不同外源激素组合超排。

3.1 单一激素超排

此法常用FSH超排，即在牦牛发情周期（发情当天计为0天）的9～13d中的任意一天开始肌肉注射FSH，以递减剂量的方式连续注射4d，每天注射2次（间隔12h），总剂量为8.0～9.0mg，不同体重、胎次的母牦牛可适当调整剂量。2004年权凯［14］采用氯前列烯醇开展母牦牛同期发情，首次在发情后第9～11d采用递减法注射总剂量为8.8mg促卵泡素（FSH，中科院动物所生产）进行超数排卵，结果发现平均每头回收的胚胎数和可利用胚数分别为5.7枚和4.0枚，与普通牛的超数排卵效果相似。而阎萍等［15］进行的高寒放牧条件下牦牛超排试验结果表面：A 组：FSH8.14mg，母牦牛与正常发育相似，冲出2枚发育正常囊胚，1头放弃；B组：FSH8.16mg，利用PVP包埋1次注射，母牦牛卵巢处于静止状况，插管1头，没有冲出胚胎，超排处理无结果。说明牦牛用FSH 8.14～8.16mg剂量偏小，对超排无效果。

3.2 不同外源激素组合超排

近年来，随着胚胎移植技术的逐渐成熟、完善和对一些常用超排激素的功能的进一步认知了解，研究者们在常用超排激素的组合使用方面进行了大量的研究，并取得了较好的效果。李全等［16］在高原放牧条件下，对6头环湖型牦牛进行了不同外源激素组合处理的超数排卵试验，结果表明：试验A组（FSH＋PG＋HCG）和试验B组（FSH＋PG）供体牛对国产激素超排处理都有反应。试验A组获黄体数超过20个，回收胚胎14枚，其中可用胚胎11枚，4～16细胞胚胎3枚；试验B组获黄体数20个，回收1枚可用胚胎，为B级囊胚。阎萍等［15］进行的高寒放牧条件下牦牛超排试验结果表面：FSH 8.18 mg，分FSH ＋ LH（200IU）、FSH ＋HCG（1 000 IU）进行超排，获14枚胚胎，有1头牦牛冲出10枚胚胎，其中有2枚发育到16细胞，1枚发育到32细胞，说明FSH＋ HCG（LH）有协同作用，促进卵巢上卵母细胞成熟和排卵。姬秋梅等［17］2005年用PGF2a＋FSH连续递减法对西藏当雄10头5～10岁供体母牦牛实施了超数排卵试验，结果为：10头供体牛共获得7枚胚胎，PGF2a＋FSH连续递减法超排效果较好。樊江峰等［18］对12头健康成年天祝母白牦牛采用CIDR＋FSH＋PG的超数排卵处理，并运用超声探测技术对超排过程中卵巢的变化情况做了全程监测。结果表明：在处理的12头牛中有5头监测到明显的卵泡闭锁现象。

4 结语

尽管近年来牦牛超数排卵技术发展迅速，并取得了很大的进步，但是超排是一个复杂的生理过程，受很多因素的影响，要使供体的超排处理得到人们所期望的效果是极不容易的。因此，随着胚胎生物工程和基因工程的不断发展，牦牛个体对超排处理的不同反应与遗传特性、年龄、营养状态、季节、开始超排日期、激素制剂中FSH／LH比例、给药途径、剂量和频率等因素的相关性都需进一步研究。

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