低频超声与抗菌药物协同增效研究进展

刘 旭，蔡 芸，白 艳，朱亚萍，王 睿（解放军总医院临床药理研究室，北京 100853）

低频超声是指超声频率范围在20 KHz ～ 1 MHz的声波。1994年，Qian等发现并将低频超声与抗菌药物的协同作用定义为声学生物效应（bioacoustic effect）[1]。近年来，低频超声技术发展迅速并在医学上得到广泛应用，可用于止痛、脱敏、溶栓、预防免疫缺陷、肿瘤治疗等[2]。无论是对浮游态的细菌还是已形成生物被膜的细菌，低频超声都可增强抗菌药物的抗菌能力[3]。目前，在低频超声与抗菌药物协同增效方面，相关研究仍处于初步发展阶段，主要用于体外与动物实验中，人体的试验则大多为治疗局部感染。本文针对近年来低频超声与抗菌药物协同增效的机制及其在浮游态细菌、细菌生物被膜感染（例如慢性创伤、植入假体的感染）、基因转染这几个方面的应用做一综述，以期为临床上应用低频超声联合抗菌药物治疗细菌感染提供参考。

1 低频超声的抗菌机制

低频超声的生物学效应主要包括机械效应、热效应、空化效应及化学效应等，其中，最主要的机制是空化效应[1,3]。空化效应是指周期性变化的高、低声压导致液体中微泡的周期性膨胀和压缩。众多研究指出，由于空化效应可导致细菌细胞膜的渗透性增加，从而提高抗菌药物的穿透能力，增强抗菌效果。空化效应分为瞬间空化效应和稳态空化效应。稳态空化效应产生微泡在压缩阶段体积逐渐缩小，并保持其稳定状态，增加微泡数量和振动幅度均可增强层流效果，加速液体中物质的运输，故当稳态空化效应发挥作用时，低频超声与抗菌药物的协同作用具有浓度依赖性。提高超声频率，抗菌药物的抗菌增效能力减弱；提高超声强度，该效力则增强，这符合稳态空化效应的机制[4]。

化学效应是许多化学物质经水解、分解或聚合改变自身结构的效应[5]，可能是由于低频超声时产生的自由基发挥作用，它攻击细菌细胞膜，增加细胞膜的渗透性，从而增强抗菌药物的抗菌作用[6-7]。

目前，低频超声对抗菌药物的协同效应，可能由以上一种或几种机制共同作用所致，但具体到某种抗菌药物和特定的细菌，确切的机制还有待研究。

2 低频超声对浮游态细菌的抗菌增效作用

低频超声联合抗菌药物对浮游态细菌可产生协同效应，可能是由于低频超声作用下，产生空化效应和化学效应，破坏了细菌细胞膜所致。

细菌对低频超声来说几乎是透明的，即超声波在经过细菌细胞时几乎没有吸收、分散或其他的作用。Pitt等[8]发现，低频超声（频率67 KHz，强度0.3 W·cm-2）单独作用时对细菌没有明显影响，但联合庆大霉素类药物时，可以增强庆大霉素对浮游态的铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑菌和杀菌作用，却对革兰阳性的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌作用不大，并且将悬浊菌液经超声辐照之后再加入抗菌药物，抗菌效力却未能增强；结果提示：对于不同种类的细菌，其协同效应不尽相同，且低频超声对细菌耐药性的影响可能是暂时性的。对此，有人提出“声孔效应”，这是由于空化效应产生的冲击波、微射流对细胞膜作用的结果，在这种作用下，细胞膜上产生可逆的孔，这种“临时通道”导致抗菌药物进入细菌内部的量增多，最终增强抗菌药物的抗菌作用[4]。Williams等[9]以庆大霉素联合低频超声（频率70 KHz，强度由4.5 mW·cm-2增加到10 mW·cm-2）对浮游态大肠杆菌作用，观察到随着强度增加，细菌的数量降低。这符合稳态空化效应作用，改变细菌细胞膜而使抗菌药物更加容易进入细菌内部[10]。Liu等[6]以低频超声（频率40 KHz，强度1 W·cm-2）联合氟喹诺酮类药物对大肠杆菌作用时，产生微泡破裂首先造成大肠杆菌细胞壁的局部损伤，而经化学效应产生·OH 和·O2-自由基攻击细菌的表面及内部，进一步损伤细菌。Zhang等[6-7]认为化学效应是低频超声提高氟喹诺酮类药物抗菌效果的主要机制。在细胞内细菌感染研究中，Yurika[11]等在体外实验研究衣原体感染Hela细胞时，超声（1.011 MHz，强度0.44 W·cm-2，0.15 W·cm-2，25%占空比，20 s）单独作用，细菌数量没有很大变化。当联合多西环素（浓度为0.5倍MIC）作用时，强度在0.15 W·cm-2和0.44 W·cm-2时，细菌IFUs分别降低至（66±39）%和（15±12）%。作者认为其机制为空化效应作用下增强抗菌药物在细胞中的传递。He等[12]认为细胞表面由于空化效应、高压等因素而增强了细胞膜的渗透性，提高抗菌药物对生物被膜的穿透能力，使抗菌效果增强。

3 低频超声在细菌生物被膜感染中的应用

目前，治疗生物被膜感染十分棘手，细菌生物被膜的生物学特性与浮游菌不同，由于细菌分泌糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等将其自身包围其中的膜样结构，导致其环境适应能力更强，可抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，耐药性极强，可达到浮游状态的10 ～ 1000倍，所致感染难以清除[13]。

低频超声联合抗菌药物对已形成生物被膜的细菌同样具有协同效应，但这种协同效应受很多因素的影响，如频率、时间、温度、pH等，对不同的菌种其效果也不尽相同。He等[4]使用超声靶向微泡破碎（频率0.08 MHz，强度1.0 W·cm-2，50%占空比，37℃，超声12 h）联合万古霉素共同作用于表皮葡萄球菌RP62A的生物被膜上，治疗后细菌数目明显下降。Rediske等[3]将培养的大肠杆菌（ATCC 10798）生物被膜埋置于新西兰白兔体内，以28.48 KHz，100 ～ 300 mW·cm-2强度进行24 h超声，结果只有当强度为300 mW·cm-2时，细菌数目发生明显下降。但应注意300 mW·cm-2的强度对人体皮肤有损害。Carmen等[14]发现低频超声（频率28.5 KHz，强度500 mW·cm-2，占空比1∶3，时间48 h）联合庆大霉素对于大肠杆菌生物被膜作用明显，而对铜绿假单胞菌生物被膜没有明显作用。低频超声增强抗菌药物对生物被膜的作用机制可能是由于空化效应破坏生物被膜而使抗菌药物穿过生物被膜的量增加所致[15-16]。有研究[17]使用低频超声（频率28.48 KHz，强度500 mW·cm-2，1∶3占空比）联合万古霉素，与单独应用万古霉素相比，在48 h其细菌数目减少了2.08 log10 cfu·cm-2（P= 0.01，n= 3），认为超声增强抗菌药物的作用，其机制可能是低频超声产生高压，高剪切力或是空化作用导致细胞膜和生物被膜被破坏。但也有研究称抗菌药物的低扩散性并非生物膜耐药性高的主要因素[18]，超声促进氧分子和营养物质穿过生物膜，同时加快细菌代谢产物排出，使“饥饿”状态的细菌得到必要的氧分子和营养物质，低代谢细菌从“冬眠”中复苏，恢复对抗菌药物的敏感性。这种机制可能起到更加重要的作用[4]。Qian等[1]以低频超声（频率500 KHz，强度10 W·cm-2，时间2 h）单独作用于铜绿假单胞菌生物被膜，用激光共聚焦显微镜观察后发现其生物被膜结构并无发生明显变化，联合庆大霉素后，生物被膜细菌活性较单独应用庆大霉素时低，而这可能是由于声孔效应发生于细菌细胞内部，但这方面需要进一步的研究。

3.1 低频超声在慢性创伤感染中的作用

60%以上的慢性创面可以检测到细菌生物被膜[19]。伤口中的细菌能够推迟或阻止伤口愈合，而生物被膜形成使其耐药性更强。近年来，低频超声技术对于慢性伤口，如糖尿病足、静脉性溃疡、动脉性或缺血性溃疡、创伤性溃疡、褥疮及有狭长瘘道的伤口等应用愈加广泛[2]。目前，低频超声作为一种替代疗法，用于多重耐药菌感染的慢性创伤病人。这可能与低频超声破坏了细菌与坏死组织形成的生物膜，进而破坏了细菌的保护机制有关。也可能因为低频超声产生空化效应，在细菌的细胞膜上“打孔”，导致细菌对于抗菌药物的吸收增多，最终达到更有效杀菌的目的[4]。

慢性鼻窦炎是一种常见的炎症疾病，鼻窦炎与鼻息肉被认为是一种免疫疾病，其影响因素很多，如免疫系统紊乱、环境因素、真菌、细菌生物被膜等。Tamas Karosi[20]应用低频超声（0.4 MHz，0.5 W·cm-2，5 min）治疗慢性鼻窦炎的体外实验中发现，在鼻息肉上皮下层，炎症细胞计数明显下降，在上皮细胞层的表面，细菌生物被膜则被完全除去。目前，美国、俄罗斯、新西兰、伊朗都有使用低频率脉冲超声治疗慢性鼻窦炎有效的报道。早期研究中的基础数据表明其作用机制可能是提高细菌的代谢速率，增强对局部抗菌药物的敏感性及改变细菌渗透性[21]。此外，Julia Escandon等[22]在治疗腿部静脉炎研究中也发现细菌数量的减少，但并不明显。糖尿病足是糖尿病控制不良导致机体免疫力降低而发生的足部感染，常见致病菌大多为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌等[23-24]。因免疫力低，糖尿病足不易治愈，严重者发生坏疽，甚至截肢。一位患有Ⅱ型糖尿病、冠状动脉疾病及外周血管疾病的72岁老年病人，其足部溃烂，经检查其伤口有葡萄球菌（4+），嗜麦芽窄食单胞菌（4+），棒状杆菌属（4+），应用25 KHz超声治疗，再应用抗菌药物，经过8周治疗后，其坏死组织清理完毕，之前暴露的骨头现在被肉芽组织覆盖，再次检查伤口发现MRSA（2+），其伤口的愈合良好[25]。

3.2 低频超声在植入假体感染中的应用

一些植入假体成为了细菌的聚集地，其感染途径很多，如外科手术时皮肤上的细菌沿着导尿管表面进入体内而造成感染[26]，目前清除感染最彻底的方法是更换植入假体，而这种方法需要病人耗费大量金钱，并且忍受极大痛苦。目前，没有非侵入性的有效方法能够治疗植入假体的生物被膜感染[27]。

最常用的是将抗菌药物置于植入假体材料中来杀死细菌。自1970年Buchholz等[26]首次将抗菌药物加载在骨水泥上，尝试应用于控制关节感染以来，人们开始认识到这种局部给药的优点。但其抗菌药物浓度下降快且只有20%能够有效的释放应用[9]。Ensing等研究低脉冲超声（28.48 KHz，500 mW·cm-2）联合载有庆大霉素骨水泥时发现，细菌生物被膜活性明显降低[27]。其机制为低频超声在增加抗菌药物释放的同时，凭借空化效应，能促进分子穿透多种生物被膜[5]，实现药物的靶向释放，并增强已释放抗菌药物的抗菌能力[29]。

4 低频超声通过影响基因表达改变细菌耐药性

低频超声可能影响细胞基因表达和细胞器的生物活性，促进抗菌药物与靶点结合，影响耐药相关基因表达和蛋白质合成，并由此改变细菌生长速率和耐药性能等生物学活性[4]。有研究发现，铜绿假单胞菌形成生物被膜后可高表达外排泵基因PA1874-1877，而将该组基因删除后，细菌耐药性明显下降[4]。

低频超声在基因转染上很有优势，其机制可能为空化效应，振动微泡周围产生的局部热效应加快了细胞内生化反应速度[5]，也可能为“声孔效应”所致[30]。 Song[31]等运用40 KHz低频超声成功地将质粒pBBR1MCS2高效率导入恶臭假单胞菌UWC1、大肠杆菌DH5a及荧光假单胞菌SBW25，并发现在细胞膜上产生了可逆的孔。超声可以促进真核细胞的基因或药物传递[32]，由电镜扫描得出其机制可能同样为“声孔效应”。然而，细菌要比真核细胞小的多，也拥有更加强韧的细胞壁，所以对于细菌的超声作用机制需更深入的研究[4]。此外，有研究称调控基因或sRNA传递能够作用于细菌沉默基因而改变其行为，sRNA和调控基因有可能被使用成为新型抗菌药物来对抗多重耐药细菌，或是抑制细菌生物被膜的形成[33]。

超声治疗是一种无创的治疗方法，损伤小并可进行靶向治疗。其次，超声在临床上应用广泛，而抗菌药物也已有几十年的使用历史，低频超声与抗菌药物联合的治疗方法，病人容易接受。第三，应用超声治疗，费用较低。但目前低频超声与抗菌药物协同增效的研究还处于初步阶段，存在许多问题需要解决，如频率、强度、时间、温度等参数上的选择，对不同药物、不同菌种，其作用机制也不尽相同。又比如空化效应作用于细菌细胞膜或细菌生物被膜，使其渗透性增加，可抗菌药物是通过何种机制进入细胞膜和生物被膜内发挥作用的并不清楚。低频超声技术联合抗菌药物的方法如需广泛应用于临床，还有待进一步研究。

[1] Qian Z, Sagers RD, Pitt WG. The effect of ultrasonic frequency upon enhanced killing of P. aeruginosa biofilms[J]. Ann Biomed Eng, 1997, 25(1): 69-76.

[2] 郭芳，胡兵. 低频超声的应用基础研究进展[J]. 声学技术，2012，31（2）：198-203．

[3] Rediske AM, Roeder BL, Brown MK,et al. Ultrasonic enhancement of antibiotic action on Escherichia coli biofilms:an in vivo model[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43(5):1211-1214.

[4] 朱晗晓，蔡迅梓，严世贵. 低频超声增强抗生素抗菌疗效研究进展[J]. 国际骨科学杂志，2009，30（5）：275-277．

[5] 刘立婷，余加林，郜向娜，等. 低频超声联合环丙沙星对铜绿假单胞菌生物被膜的杀菌作用及其结构的影响[J]. 中国超声医学杂志，2011，27（7）：577-580.

[6] Liu B, Wang DJ, Liu BM,et al. The influence of ultrasound on the fluoroquinolones antibacterial activity[J]. Ultrason Sonochem,2011, 18(5): 1052-1056.

[7] Zhang L, Mah TF. Involvement of a novel efflux system in biofilm-specific resistance to antibiotics[J]. J Bacteriol, 2008,190(13): 4447-4452.

[8] Pitt WG, McBride MO, Lunceford JK,et al. Ultrasonic enhancement of antibiotic action on gram-negative bacteria[J].Antimicrob Agents Chemother, 1994, 38(11): 2577-2582.

[9] Williams RG, Pitt WG. In vitro response of Escherichia coli to antibiotics and ultrasound at various insonation intensities[J]. J Biomater Appl, 1997, 12(1): 20-30.

[10] Yu H, Chen S, Cao P. Synergistic bactericidal effects and mechanisms of low intensity ultrasound and antibiotics against bacteria: a review[J]. Ultrason Sonochem, 2012, 19(3): 377-382.

[11] Ikeda-Dantsuji Y, Feril LB Jr., Tachibana K,et al. Synergistic effect of ultrasound and antibiotics against Chlamydia trachomatis-infected human epithelial cells in vitro[J]. Ultrason Sonochem, 2011, 18(1): 425-430.

[12] He N, Hu J, Liu H,et al. Enhancement of vancomycin activity against biofilms by using ultrasound-targeted microbubble destruction[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(11):5331-5337.

[13] Hill D, Rose B, Pajkos A,et al. Antibiotic susceptabilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions[J].J Clin Microbiol, 2005, 43(10): 5085-5090.

[14] Carmen JC, Roeder BL, Nelson JL,et al. Treatment of biofilm infections on implants with low-frequency ultrasound and antibiotics[J]. Am J Infect Control, 2005, 33(2): 78-82.

[15] Case PD, Bird PS, Kahler WA,et al. Treatment of root canal biofilms of Enterococcus faecalis with ozone gas and passive ultrasound activation[J]. J Endod, 2012, 38(4): 523-526.

[16] Forbes MM, O'Brien WD Jr. Development of a theoretical model describing sonoporation activity of cells exposed to ultrasound in the presence of contrast agents[J]. J Acoust Soc Am, 2012,131(4): 2723-2729.

[17] Carmen JC, Roeder BL, Nelson JL,et al. Ultrasonically enhanced vancomycin activity against Staphylococcus epidermidis biofilms in vivo[J]. J Biomater Appl, 2004, 18(4): 237-245.

[18] Carmen JC, Nelson JL, Beckstead BL,et al. Ultrasonic-enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli[J]. J Infect Chemother, 2004,10(4): 193-199.

[19] 付小兵. 细菌生物膜形成与慢性难愈合创面发生[J]. 创伤外科杂志，2008，10（5）：416-417.

[20] Karosi T, Sziklai I, Csomor P. Low-frequency ultrasound for biofilm disruption in chronic rhinosinusitis with nasal polyposis:In vitro pilot study[J]. Laryngoscope, 2012, Aug 14. doi: 10.1002/lary. 23623. [Epub ahead of print]

[21] Patel ZM, Hwang PH, Chernomorsky A,et al. Low-frequency pulsed ultrasound in the nasal cavity and paranasal sinuses: a feasibility and distribution study[J]. Int Forum Allergy Rhinol,2012, 2(4): 303-308.

[22] Escandon J, Vivas AC, Perez R,et al. A prospective pilot study of ultrasound therapy effectiveness in refractory venous leg ulcers[J]. Int Wound J, 2012, 9(5): 570-578.

[23] 徐灵芝，杨叶虹，叶红英，等. 糖尿病足感染的细菌学特点与预后分析[J]． 浙江临床医学，2008，10（4）：451-452.

[24] 温志刚，郑亮，林小玲. 糖尿病足感染细菌培养及相关因素分析[J]. 临床合理用药杂志，2012，5（9A）：17-18.

[25] Breuing KH, Bayer L, Neuwalder J,et al. Early experience using low-frequency ultrasound in chronic wounds[J]. Ann Plast Surg,2005, 55(2): 183-187.

[26] Morck DW, Olson ME, McKay SG,et al. Therapeutic efficacy of fleroxacin for eliminating catheter-associated urinary tract infection in a rabbit model[J]. Am J Med, 1993, 94(3A): 23S-30S.

[27] Ensing GT, Roeder BL, Nelson JL,et al. Effect of pulsed ultrasound in combination with gentamicin on bacterial viability in biofilms on bone cements in vivo[J]. J Appl Microbiol, 2005,99(3): 443-448.

[28] Buchholz HW, Engelbrecht H. [Depot effects of various antibiotics mixed with Palacos resins][J]. Chirurg, 1970, 41(11):511-515.

[29] 王祥华，蔡迅梓，严世贵，等.低频超声下万古霉素骨水泥的抗菌性能及安全性的研究[J].中华医学杂志，2006，86（45）：3215-3216.

[30] Lin L, Song H, Ji Y,et al. Ultrasound-mediated DNA transformation in thermophilic gram-positive anaerobes[J]. PLoS One, 2010, 5(9): e12582.

[31] Song Y, Hahn T, Thompson IP,et al. Ultrasound-mediated DNA transfer for bacteria[J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35(19): e129.

[32] Mohan P, Rapoport N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking[J]. Mol Pharm, 2010,7(6): 1959-1973.

[33] Storz G, Haas D. A guide to small RNAs in microorganisms[J].Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2): 93-95.