食品中磺胺类药物残留检测方法研究进展

何红春

（高邮市产品质量监督检验所，江苏 高邮225600）

1 引言

磺胺类（Sulfonamides，SAs）是具有对氨基苯磺酸苯磺酰结构的合成抗菌素的总称，是合成的抑菌药，对大多数革兰氏阳性和许多革兰氏阴性细菌有较强的抑制作用[1～7]，具有抗菌谱广、性质稳定、体内分布广、制造不需粮食作原料、产量大、品种多、价格低、使用简便、供应充足等优点，目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一，在食源性动物的饲养中被广泛应用。人类经常食用有磺胺类药物残留的动物源性食品，可能引起磺胺类药物在体内的逐渐累积。其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌作用以及激素样作用等。目前中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物。日本把磺胺类最大残留限量从100μg/kg降为50μg/kg，欧盟规定牛奶和肉类食品磺胺类药物总量≤100μg/kg[8]。美国规定牛奶中磺胺类药物的MRLs为10μg/L。我国农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定牛奶中磺胺类药物的最高残留限量为0.1 mg/L[9]。

目前，针对磺胺类兽药残留的检测方法有薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）法、液质联用（HPLCMS、HPLC－MS/MS）、气相色谱（GC）、气质联用（GC－MS、GC－MS/MS）；酶联免疫吸附（ELISA）、胶体金免疫技术（Immune colloidal gold technique）和毛细管电泳（HPCE）法等。

2 作用机制和毒理学性质

磺胺类药物作用的靶点为细菌的二氢叶酸合成酶，使其不能充分利用对氨基苯甲酸合成叶酸。二氢叶酸合成酶催化的是对氨基苯甲酸、谷氨酸及二氢蝶啶焦磷酸或对氨基苯甲酰谷氨酸与二氢蝶啶焦磷酸合成二氢叶酸的反应，二氢叶酸再经二氢叶酸还原酶作用还原生成四氢叶酸，四氢叶酸可进一步合成叶酸辅酶F，为细菌DNA中核苷酸的合成提供一碳单位。

磺胺药与对氨基苯甲酸产生竞争性拮抗作用，从而阻止了细菌二氢叶酸的合成，进而抑制了细菌的生长繁殖。

大多数磺胺类药物可广泛渗入全身组织和细胞外液，能透过血脑屏障进入脑脊液。主要在肝脏内乙酰化为无抗菌活性代谢产物，但仍有磺胺类毒性，可在中性或酸性条件下沉淀为结晶尿，损伤肾脏。主要经肾小球滤过而排泄，部分药物可经肾小管重吸收。有少量从乳汁、胆汁和粪便排出。肾功能障碍时，母体化合物和代谢产物可在体内积累，也可由于肾脏排出缓慢而增强乙酰化作用从而导致毒性增大。

3 检测方法进展

3.1 仪器分析法

3.1.1 液相色谱分析法

高效液相色谱法是分析磺胺类药物残留的国际公认方法，具有选择性强、灵敏度高、检出限低等优点[10～14]。

何红梅等[10]采用C18色谱柱（250mm×4.6mm）作固定相，以乙腈（A）及乙腈＋乙酸＋水（20＋1＋79）的混合液（B）按不同比例作流动相进行梯度淋洗使5种磺胺药物分离，最后在270nm波长处作紫外检测。方法的测定下限（S/N＝10）为0.04mg/kg，以猪肉样品为基体加入3种药物的标准溶液进行回收试验，测得回收率在73.65%～93.45%之间。

刘海新等[11]建立了鳗鱼肌肉中磺胺类药物残留的高效液相色谱柱后衍生分析方法。样品经乙腈和水提取，液－液分配和固相萃取净化浓缩后，采用高效液相色谱柱后衍生法检测磺胺类药物经C18色谱柱分离，在柱后反应单元中与荧光胺反应，生成具有荧光特性的分子，荧光检测器检测方法定量检测限为2.0μg/kg，回收率为85.1%～90.2%，相对标准偏差2.74%～6.04%。

张萍等[12]采用固相萃取－高效液相色谱法同时测定鸡蛋粉中12种磺胺类药物残留量，样品用乙腈提取，正己烷脱脂，抽干，盐酸酸化，过WatersOasisMCX小柱净化，用甲醇淋洗杂质，6%的氨化甲醇溶液洗脱磺胺类药物，洗脱液氮气吹干，流动相溶解后上HPLC仪分析，鸡蛋粉中12种磺胺药物的最小检出限在0.002～0.045μg/g。

林海丹等[13]研究了动物源性食品中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹啉药物残留的提取、净化和高效液相色谱分析条件，建立了高效液相色谱法同时测定动物源性食品中磺胺类药物残留的方法，该法检出限为0.010×10－6～0.020×10－6（w），添加回收率为71%～83%。

余辉菊等[14]采用新的样品前处理方法：基质固相分散萃取技术对牛奶中残留的磺胺类药物进行提取和净化，HPLC法测定。8种磺胺类药物的回收率在68.3%～101.2%之间，相对标准偏差在2.4%～7.6%之间，该方法样品前处理简单、快速，定性定量准确，分析成本低，易于推广应用。

高效液相色谱检测方法分析食品中药物残留，样品前处理步骤往往占去整个分析时间的70%～90%，成为制约食品分析速度的瓶颈。而且样品前处理用大量有机溶剂提取，对人体伤害比较大，分析周期长，所以不适用药物的快速检测。

3.1.2 液质联用分析法

近年来，随着质谱技术的发展，联用技术在磺胺药物残留分析中，不但能提供结构信息，而且灵敏度高，选择性好，特异性强，因此越来越用于磺胺类药物残留的确证分析[15～18]。

蒋原等[15]利用高效液相色谱－电喷雾串联质谱测定了蜂蜜、蜂王浆、鮰鱼、鳗鱼、猪肉、猪肾、猪肝、鸡肉、牛肉和牛奶中的三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧苄氨嘧啶和奥美普林3种磺胺类药物增效剂。通过实际样品添加回收实验，所有基质定量下限为5.0μg/kg，3个添加水平的回收率为63%～89%，相对标准偏差为3.2%～6.9%。

范莹莹等[16]建立一种用高效液相色谱与质谱联用法测定猪肉组织中磺胺类药物残留的方法。样品经2%的醋酸水溶液提取后通过固相萃取柱净化，用甲醇洗脱，吹干，然后用流动相A溶解，用DAD及MS检测器检测。该方法回收率范围为55.3%～102.8%，相对标准偏差在0.79% ～10.4%之间，方法的最低检出限为0.1～0.5ppb。

陈莹等[17]采用超高效液相色谱串联质谱法对鳗鱼中大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类兽药残留量进行测定的同时测定鳗鱼组织。采用多反应监测模式进行测定，外标法定量，在酸化条件下用乙腈提取，经正己烷除油，检出限为0.1～0.2μg/kg，回收率60%～97%，相对偏差不大于12.6%，线性回归相关系数在0.9974～0.9999之间。

吴西梅等[18]用高效液相色谱电喷雾质谱（ESIMSn）测定肉品中的磺胺二甲嘧啶，通过多级质谱对阳性样品确证。以二级碎片做定量离子，磺铵二甲嘧啶测定线性范围为25～400μg/L，最低检出浓度为5μg/L。该方法简便快速，检出限低。

液相色谱－串联质谱仪法测定磺胺类药物残留，由于以子离子和母离子定性和定量，能够假阳性，而且样品前处理比液相色谱简单，不需要衍生化，离子碎片特征性强，提供的信息丰富，灵敏度高，检出限低，能够达到欧盟和日本等对进口水产品最高残留量的要求，但是其仪器设备的购置和运行费用较高，成为常规分析方法尚有待进一步研究。

3.2 免疫分析法

由于近代免疫学和免疫技术的快速发展，免疫分析法成为近年来迅速发展起来的一种药物残留的检测方法。免疫分析法是以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础，适用于组织中痕量组分的分析，可以用于规模化的筛选。目前用于磺胺类药物残留检测的免疫分析法主要放射免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA）两种，此类方法不仅灵敏度高、准确性好，同时还具有操作简单、快速、检测成本低、适用于大批量样品检测的优点。

3.2.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）是较早应用的一种免疫分析技术，利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法，又称竞争性饱和分析法。RIA法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等，缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等。传统的放射免疫分析法检测磺胺类药物残留，检出限较高，所以应用较少。林杰等[19]人曾应用charm放射免疫分析法测定了商品虾中磺胺类药物残留，并探讨了检测过程中时间因素对样品检测数据的影响。

3.2.2 酶联免疫法

酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。酶联免疫试剂盒是酶免疫测定技术中应用最广的技术。由于ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和广泛应用。万宇平等[20]在常规酶联免疫法的基础上，将磺胺类母核与牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制得磺胺类单克隆抗体，并进一步优化抗体工作浓度、反应时间等实验参数，建立了一种简便、快速、精确的磺胺类残留一步式化学发光酶联免疫检测方法，与常规ELISA方法相比，检测限和灵敏度基本一致，但反应时间缩短了60min，证明采用一步式化学发光酶联免疫检测磺胺类残留可以大幅度缩减检测时间，符合快速检测的要求。

3.2.3 胶体金免疫分析法

胶体金免疫技术（Immune colloidal gold technique）是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，它具有简便、快速、特异性强、灵敏度高、费用低的优点。李奎等[21]人采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用胶体金标记抗磺胺类药物母核结构单克隆抗体，磺胺类药物竞争物包被于硝酸纤维素膜，制成免疫层析快速检测试纸条，该方法可以在15min内完成对磺胺类药物的半定量残留检测，可作为磺胺类药物残留的快速筛选方法。

药物残留检测试剂盒具有简便迅速、特异性强、灵敏度高、样品预处理简单等优点，能满足磺胺类药物残留的快速检测的要求。由于磺胺类药物是小分子物质，没有免疫原性，必须连接到大分子载体上产生特异性免疫应答，所以药物残留试剂盒在稳定性和准确度方面存在一定的局限性，检测过程中容易出现假阳性，所以限制了其应用。

4 研究展望

磺胺类药物残留的检测从早期的分光光度法、荧光法、到近些年的色谱分析、质谱的分析法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法，几乎所有的分析理论和技术在SAs残留分析中都得到了研究和应用，其中采用最多的筛选方法是反相高效液相色谱法（HPLC），后来发展的酶联免疫吸附测试方法（EL ISA）作为筛选方法也得到了广泛的应用。

随着人们对水产类食品安全问题的日益关注，对兽药残留检测方法的精确度、时效性要求越来越高，人们不断地探索研究新技术并将其应用于磺胺类药物残留的检测。仪器分析法在药物残留方面的检测会越来越受到重视，液相色谱法具有高灵敏度、低检出限、准确重复性好的优点，在今后一段时间内，还是磺胺类药物检测的常用方法。液质联用法前处理比较简单，耗时少，灵敏度高，检出限低，满足检测要求，但是成本比较高，仪器价格昂贵，是未来的发展趋势。随着技术的提高，酶联免疫试剂盒测定药物残留能够大大提高检测效率和满足多样品的同时检测。随着方法的不断改进、材料的不断更新，其会更为简便实用，标准化免疫法能够成为药物残留的快速检测方法。

食品中磺胺类药物残留关乎人民群众的生命健康，仅仅提高检测技术是不行的，要提高广大民众的认识，建立健全法制法规，广泛宣传增强法制观念，严惩触犯食品安全的企业和个人，切实提高我国食品安全水平。

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