一株沥青质降解菌的筛选及其对稠油作用评价＊

宋永亭，宋 欣，高光军，陈庆国，李 阳，包木太†

（1.中国海洋大学 化学化工学院，山东 青岛 266100； 2.海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室（中国海洋大学），山东 青岛 266100； 3.中国石化股份胜利油田分公司采油工艺研究院，山东 东营 257000； 4.中国石油化工股份有限公司，北京 100728）

目前在中国探明石油储量中，开发难度较大的稠油接近40亿吨，其资源量约占总石油资源的25%～30%，稠油开发日益显示出重要的战略地位.高黏度是稠油区别于常规原油的最基本特性，同时也是决定稠油开采难度和经济成本的关键因素.稠油往往富含沥青质，沥青质是稠油组分中相对分子质量最大、极性最强的组分，也是造成稠油黏度大、开采难的一个主要因素[1－3].

利用微生物作用于稠油，改善稠油物性是石油开发领域的一项新兴技术.目前的研究主要集中在微生物产生生物表面活性物质、酸、气等代谢产物降低稠油黏度；在微生物对稠油中大分子组分的降解作用方面，国内外研究人员也做过一些探索研究.但是，关于能以沥青质为唯一碳源生长，特异性降解沥青质的菌种的相关研究报道较少[4－7].本文以沥青质为唯一碳源，从稠油油田采出水中选择性富集筛选沥青质降解菌，获得了一株能够以稠油中沥青质组分为唯一碳源生长的菌株S，利用该菌株对富含沥青质的稠油进行了微生物降解评价实验，分析了菌株对稠油物理化学性质的影响.

1 材料与方法

1.1 实验材料

正庚烷，甲苯，硝酸铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，氯化钙，氯化钠，葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，琼脂粉，稠油（黏度3 581mPa·s），Taqmix扩增体系.沥青质抽提器，密度仪，黏度计，原油族组分测试仪，红外光谱仪，核磁共振仪，天平，真空干燥箱，振荡培养箱，PCR仪.

1.2 实验方法

1.2.1 沥青质降解菌的筛选

富集培养基：NH4NO3，1.0g／L；K2HPO4，1.5 g／L；KH2PO4，0.5g／L；MgSO4·7H2O，0.5g／L；CaCl2，0.02g／L；沥青质，7g／L；调节pH 值至7.

固体 培 养 基：葡 萄 糖，3.0g／L；蛋 白 胨，3.0g／L；酵母浸粉，3.0g／L；NaCl，5.0g／L；K2HPO4，2.7g／L；琼脂，20g／L；调节pH 值至7.

取10mL某稠油油田采出水于富集培养基内，37℃，160r／min振荡培养14d后，将培养液在固体培养基上进行划线分离，对作用前后的沥青质进行红外光谱和相对分子质量分析.

其中，稠油沥青质的提取及其稠油族组分含量测定，采用中华人民共和国石油天然气行业标准SY／T 5119—1995[6]进行；红外光谱图采用尼高力IR200红外光谱仪测定；沥青质相对分子质量采用蒸气压渗透法测定.

1.2.2 沥青质降解菌的分子生物学鉴定

菌株16SrDNA测序：从固体平板上挑取少量菌体，用无菌水洗涤3次，离心取沉淀，稀释液体作为模板，引物为细菌16SrDNA的PCR通用引物（27F，1492R），使 用 TIANGEN 公 司 生 产 的Taqmix体系进行PCR扩增.扩增产物送大连宝生物公司测序，将测序结果用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较.

1.2.3 沥青质降解菌的稠油作用评价

评价培养基：NH4NO3，1.0g／L；K2HPO4，1.5 g／L；KH2PO4，0.5g／L；MgSO4·7H2O，0.5g／L；CaCl2，0.02g／L；稠油，10g／L；调节pH 值至7.

将活化的沥青质降解菌的种子液按1%接种量接入评价培养基内，37℃，160r／min振荡培养14 d，同时将不接菌的评价培养基在相同条件下培养，作为空白对照，对比两者的稠油外观、族组分、红外光谱、支化指数、密度及黏度的差异.

其中，稠油核磁共振谱图采用Bruker AVANCE 500Hz 500MHz超导核磁共振仪测定；稠油黏度采用中华人民共和国石油天然气行业标准SY／T 7549—2000测定；稠油密度采用煤油稀释法测定[8].

2 结果分析

2.1 沥青质降解菌S的筛选与鉴定

通过分离纯化，得到一株能以沥青质为唯一碳源生长的菌株S.对菌株S进行革兰氏染色表明，菌株S为革兰氏阳性菌，短杆状.利用细菌16SrDNA通用引物扩增菌株S的16SrDNA部分片段，将其序列提交GenBank数据库进行系统发育对比，序列分析显示菌株S与Bacillus属的已确定的种的相似度为94%～99%，其中与BacillussubtilisBSn5的相似度最高，达到99%.系统发育树用MEGA 3.1软件建立，如图1所示，显示菌株S属于Bacillus属.

图1 菌株S的16SrDNA序列系统发育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of 16SrDNA sequence of strain S

菌株S作用前后沥青质的相对分子质量的测定结果见表1.菌株S作用后沥青质相对分子质量降低，与作用前相比降幅达5.9%.

表1 菌株S对沥青质相对分子质量的影响Tab.1 Molecular weight change of asphaltene before and after biodegradation by strain S

菌株S作用前和作用后的沥青质红外谱分析结果如图2所示.

图2 菌株S对沥青质红外谱图的影响Fig.2 FTIR spectrum of asphaltene by strain S

从图2可以看出，与作用前相比，菌株S作用后沥青质在3 396cm－1处吸收峰锐减，该峰属于分子间氢键多聚缔合的谱峰，表明菌株S作用后重质组分之间相互缔合的程度降低；在2 800～3 000cm－1处吸收峰增强，该峰是由于环烷烃和烷烃C－H振动产生的结果，表明沥青质的分子结构更趋于饱和；1 600cm－1处吸收峰减弱，该峰是苯环吸收峰，表明沥青质中芳香类结构减少；1 032cm－1处吸收峰略有增加，该峰是C－O键吸收峰，表明产生了氧化性产物.根据以上分析推测，菌株S通过对沥青质的氧化作用，一方面降低重质组分之间相互缔合的程度，另一方面减少芳香类结构，使沥青质的饱和程度增加.

2.2 菌株S对稠油作用效果评价

2.2.1 稠油外观变化

经过14d的培养后，空白对照实验样品中的稠油的外观没有变化，仍然呈现聚集状态.与空白对照相比，接入菌株S的实验样品中的稠油在菌株S的作用下发生了明显的乳化现象，并由最初的聚集状态转变为细小颗粒状[9].稠油的表观变化说明菌株S对稠油具有良好的乳化效果，如图3所示.

图3 空白对照与经菌株S作用后稠油的表观变化图Fig.3 The apparent change of heavy oil before and after biodegradation by strain S

2.2.2 稠油红外光谱变化

培养14d后，分别取出空白对照及经菌株S作用后的稠油，进行红外光谱分析，谱图如图4所示.

从谱图可以发现，在2 800～3 000cm－1处稠油的红外光谱出现很强的吸收峰，这些强的吸收峰是环烷烃和烷烃C－H振动的结果，其中以2 923 cm－1和2 852cm－1的－CH2－的吸收最强.1 455 cm－1和1 372cm－1附近均显示出明显的脂肪烃甲基和亚甲基的面内伸缩振动吸收峰.而1 455cm－1和1 598cm－1出现相对强峰可以表明该化合物中含有芳核结构.

对比空白对照样与经菌株S作用后的稠油红外光谱图的变化可看出，经菌株S作用后稠油在3 450 cm－1处谱峰明显减弱，该峰属于分子间氢键多聚缔合的谱峰，表明菌株S作用后重质组分之间相互缔合的程度降低.从谱峰含量上来看2 800～3 000 cm－1，2 922cm－1和2 852cm－1处谱峰都有不同程度增加，可以认为减弱的重质组分相应转化为饱和组分及芳香组分.

图4 空白对照与经菌株S作用后稠油的红外光谱图Fig.4 FTIR spectrum of heavy oil before and after biodegradation by strain S

2.2.3 稠油支化指数变化

核磁共振波谱广泛用于有机化合物及其混合物的结构分析，1H－NMR（核磁共振氢谱）可以很清楚地区分与芳香碳相连的氢以及与饱和碳相连的氢.石油烃的支化指数（BI）是指其中碳链的分支程度[10].

式中：Hβ为芳香环β碳上的氢以及β位以远的CH2和CH基上的氢原子数；Hγ为芳香环的γ位以及γ位以远的CH3基上的氢原子数.

对菌株S作用后的稠油样品和未添加菌株S的空白对照样品利用核磁共振进行了检测，对比谱图发现2个样品的谱图具有明显差异；而未添加S的样品在培养前后无明显差异，因此，仅给出空白和菌株S作用后的稠油核磁共振谱图（如图5所示）.根据谱图得到不同稠油样品相应的支化指数，见表2.

从表2中数据可看出，稠油经菌株S作用后样品支化指数升高，这可能是由于稠油中沥青质含量相对高，而沥青质是以稠合芳香环系为核心，经菌株S作用后，其芳香环发生断链开环作用，导致与芳香环相连的支链增多.

图5 空白对照与经菌株S作用后的稠油核磁共振谱图Fig.5 NMR spectrum of heavy oil before and after biodegradation by strain S

表2 菌株S对原油的支化指数的影响Tab.2 Influence of biodegradation on branching index of heavy oil by strain S

2.2.4 稠油族组分变化

测试了菌株S作用前后稠油样品的族组分变化.添加菌株S培养14d后，稠油组分中的芳香烃含量增加最高，烷烃次之，而沥青质含量则大幅度降低，其沥青质降解率达到了34.87%.而未添加菌株S的空白对照在培养前后稠油组分没有明显变化，见表3.这是由于菌株S主要是作用于稠油中的沥青质，使沥青质结构发生变化，相应转化为其他组分，从而改变了稠油族组分的结构组成.沥青质是影响稠油黏度的主要因素之一，它的减少会使稠油黏度降低[11]，从而增加稠油流动性

2.2.5 稠油黏度与密度变化

通过对菌株S作用前后稠油黏度及密度的测定发现，添加菌株S培养14d后，稠油的黏度和密度都有不同程度的降低.而未添加菌株S的空白对照在培养前后稠油组分没有明显变化，见表4.

表3 菌株S对稠油族组分的影响Tab.3 Influence of biodegradation on composition of heavy oil by strain S %

表4 菌株S对稠油黏度、密度的影响Tab.4 Influence of biodegradation on viscosity and density of heavy oil by strain S

加入菌株S作用后，稠油的黏度、密度均降低.稠油黏度由作用前的3 576mPa·s降低至2 356 mPa·s，降黏率达到34.11%.稠油密度从作用前的0.997 3g·cm3降低至0.951 7g·cm－3，降幅达到4.57%.由此可看出，菌株S在一定程度上改变了稠油的物性.

3 结 论

1）通过一系列筛选实验，得到一株能以稠油沥青质为唯一碳源生长的菌株S，分子生物学分析结果表明，菌株S属于Bacillus属，与BacillussubtilisBsn5的序列相似度达99%.

2）菌株S以沥青质唯一碳源，在有氧条件下利用氧化作用，一方面降低重质组分之间相互缔合的程度，另一方面减少芳香类结构，使沥青质的饱和程度增加.菌株S作用后，沥青质相对分子质量降低5.9%.

3）菌株S能改变稠油组分，其作用稠油后可以导致组分中沥青质含量降低及烷烃含量相应升高.

4）稠油经菌株S作用后，黏度和密度均出现不同幅度的降低，作用14d的降黏率达34.11%，密度降低了4.57%，物性得到明显改善，表明菌株S在稠油的微生物开采和改质应用方面具有一定潜力.

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