犬肺静脉的组织学与HCN通道的表达研究

胡明艳，陈尚超，陈曼华

（1.湖北省武汉市中心医院心内科 430014；2.湖北省武钢二医院神经内科 430085）

近年来，许多研究证实来源于肺静脉的快速局灶性冲动在心房颤动（以下简称房颤）的诱发及维持上起着重要的作用［1－2］。超搏电流（funny current，If）离子流是心脏起搏电流的重要组成部分，其活动增加，会导致自律性增加，容易引起快速心律失常。亚单位超极化激活的环核苷酸门控通道（hyperpolarization－activated cyclic nucleotide－gated cation channel，HCN）是可以产生类似心脏If或神经元Ih电流的一类通道基因家族，每一亚单位形成的离子通道均具有内在If的主要特征［3－4］，肺静脉存在自发活动，就很可能有该通道的存在。本实验观察了犬肺静脉肌袖的基本组织结构，采用组织化学染色及分子生物学技术，从多个角度证实肺静脉中有传导细胞的存在，并探讨犬快速心房起搏后急性房颤时HCN的变化，为揭示肺静脉引发房颤的机制提供客观的依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及分组 14只健康成年犬，雌雄不限，体质量10～20kg，7只快速心房起搏作房颤组，其余7只未经快速心房起搏处理为对照组。3%戊巴比妥钠30mg／kg静脉麻醉，气管插管，必要时呼吸机辅助呼吸。沿胸骨正中切口，逐层开胸，切开心包暴露心脏。用心脏电生理刺激仪（SEN－7103型，日本产）经右心房电极给予600次／分、脉宽2ms、4倍阈值的高速心房起搏脉冲直至诱发房颤；动态记录犬肢体6导联心电图。一旦房颤自行终止则继续心房起搏诱发房颤。维持高速心房起搏／房颤8h。7只犬均诱发出房颤。处死动物，留取部分肺静脉及左心房组织，置入液氮速冻后，－80℃存放。

1.2 苏木素－伊红（HE）及高碘酸－希夫反应（PAS）染色 将对照组犬麻醉后迅速开胸，剪取左心房与肺静脉交接处向上延伸约1cm的肺静脉肌袖组织，剪去肺静脉肌袖内外膜，将组织块固定于10%中性甲醛溶液中24h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，沿血管走行作纵向连续切片，厚5μm，每隔5张取1张做HE染色，其间隔的5张做PAS染色。

表1 引物序列与反应条件

1.3 逆转录－PCR（RT－PCR）测两组犬肺静脉及左心房心肌HCN1、2、4的mRNA表达 取100mg冷冻组织，用Trizol试剂一步法提取肺静脉及左心房心肌细胞的总RNA。在紫外分光光度计上测定总RNA的浓度及纯度，采用TaKaRa一步法RT－PCR试剂盒（购至大连宝生物工程有限公司），进行逆转录和PCR。总反应体系为25μL，分别依次加入总RNA1μL（≤1μg），10×缓冲液2.5μL，dNTP2.5μL，MgCl2（25mmol／L）5μL，RNA 酶抑制剂（40μ／μL）0.5μL，AVM 逆转录酶（5μ／μL）0.5μL，Taq酶（5μ／μL）0.5μL，上下游特异性引物（由上海生物工程有限公司合成）各0.5μL，加无RNA酶水至25μL。50℃30min逆转录，94℃2min预变性，开始循环：94℃变性30s，退火（温度见表1）30s，40个循环后延伸于72℃，45s；最后4℃保存10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，并采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行灰度计算，以βactin为参照，求出其相对值。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料用表示，不同组间的参数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色检测肺静脉纤维的走行方向 肺静脉肌袖组织分为内膜层、中层和外膜层，中层较厚，心肌细胞集合成束，呈纵行、环形和斜行排列。肺静脉、尤其是肺静脉左心房交界处肌纤维的排列方向复杂，走向紊乱（图1A、B）。

2.2 PAS染色观察传导细胞 肺静脉肌袖的心内膜面可见大量PAS染色阳性的细胞（即传导细胞）。左心房与肺静脉交界处也可见PAS染色阳性的细胞，这些细胞的胞浆染色较淡，且一般比周围PAS染色阴性的细胞大（图2A～C）。

图2 PAS染色观察传导细胞

2.3 RT－PCR扩增结果 以100bp DNA Ladder的分子标记物为标志，两组犬的肺静脉与左心房组织中分别于393、313、392bp处可见扩增产物，320bp处无扩增产物，电泳带的位置分别与 HCN2、HCN4、β－actin理论值相符（图3～6）。

2.4 两组犬肺静脉及左心房中HCN1、2、4mRNA表达变化两组犬肺静脉的HCN4mRNA表达水平均明显高于左心房（P＜0.05），房颤组肺静脉与左心房的 HCN2、HCN4mRNA表达水平较对照组均明显升高（P＜0.05），且房颤组肺静脉中HCN2的mRNA表达水平明显高于房颤组左心房，但对照组肺静脉与左心房的HCN2mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图3 对照组肺静脉各目的基因及内参的RT－PCR电泳图

图4 对照组左心房心肌各目的基因及内参的RT－PCR电泳图

图5 房颤组肺静脉各目的基因及内参的RT－PCR电泳图

图6 房颤组左心房心肌各目的基因及内参的RT－PCR电泳图

表2 两组犬肺静脉与左心房心肌HCN1、HCN2、HCN4mRNA表达的比较（，n＝7）

表2 两组犬肺静脉与左心房心肌HCN1、HCN2、HCN4mRNA表达的比较（，n＝7）

－：未测到mRNA表达量；a：P＜0.05，与同组左心房比较；b：P＜0.05，与对照组相同部位比较。

组别 部位HCN1 HCN2 HCN4对照组 左心房 － 0.646±0.082 1.066±0.404肺静脉 － 0.562±0.081 1.567±0.042a房颤组 左心房 － 0.850±0.107b 1.795±0.032b肺静脉 － 1.230±0.088ab 2.113±0.151ab

3 讨 论

肺静脉的解剖结构与阵发性房颤的关系密切，既往有研究发现肺静脉中存在由左心房延伸到肺静脉的心肌袖，并且具有电活动［5－6］。本研究采用HE染色观察到犬肺静脉肌袖心肌纤维呈各种方向排列，但多数呈交错缠绕的非均一性排列，心肌纤维集合成束，呈环形、纵形和斜形排列。有学者认为肺静脉肌袖的心肌细胞排列混乱，可能是导致该部位电活性不均一的基础，进而易于诱发折返［7］，导致房颤的发生。

起搏细胞是心脏产生起搏的基础，有研究发现，在传导组织以外的不同部位还散在、无规律地分布着单个P细胞或P细胞团［8－9］。大量动物研究已证实［10－11］，肺静脉肌袖组织中存在单个或聚集分布的P样细胞，神经内分泌机制可以调节其电活动，使其易于产生自律性增高的电活动，成为异位兴奋灶，导致局灶性房颤的发生。当窦房结和心房的功能正常时，P样细胞的起搏功能被心脏正常节律所抑制。当机体神经内分泌等因素发生变化时，肺静脉肌袖组织中的P样细胞以触发或驱动机制导致房颤的发生。而肺静脉肌袖肌纤维的环形、斜行和纵行分布，使P样细胞产生的激动在肺静脉内传导方向和速度不同，产生传导延迟或阻滞，为微折返环形成创造条件，这些因素均可协同促进房颤的发生与维持。PAS染色常用于检测蒲肯野纤维及其他心肌传导细胞中的糖原［12］，本实验就采用此方法在肺静脉中发现了染色阳性的细胞，初步说明肺静脉中有传导细胞的存在。这些细胞可以产生自律性的电活动，从而构成了肺静脉源性房颤的组织细胞学基础。

HCN通道有4种亚型，在哺乳动物心脏中目前发现只有HCN1、HCN2及 HCN43种亚型表达［3］，它们所产生的电流均具有典型的If电流特征，然而其在肺静脉的表达及该电流在房颤中所起的作用还不是很清楚。本实验对犬肺静脉中HCN通道的mRAN表达水平进行了研究，证实了肺静脉中有该通道的存在。HCN4是产生起搏电流的主要离子通道，与传导组织的自律性细胞密切相关［13］，是正常起搏电流产生的重要因素，这与本实验的结果是一致的，两组的肺静脉与左心房中都是以HCN4为主，肺静脉更高，这可能也是其If电流增高的原因之一。以往的研究表明在病理情况下If的表达是增加的。If通道mRNA在充血性心力衰竭左心房充盈压升高时表达增加，而房颤患者升高更明显，提示房颤的发生可能与If过度活动有关［14］。本实验发现房颤组肺静脉与左心房的HCN4、HCN2的mRNA表达水平均明显高于对照组，并且两组肺静脉中HCN4的mRNA表达均明显高于左心房，这种差异性可能是其离子流差异的分子基础，从而导致复极异质性，利与房颤的发生。

HCN2通道主要与非自律性的心肌相关，并与舒张期膜电位的维持有关［15］，本实验发现对照组肺静脉与左心房组织中HCN2的浓度无明显差异，说明其在肺静脉心肌自发活动中可能不起关键作用。肺静脉肌袖能够产生舒张期自动除极可能并不是由单一的If电流引起，而是由于多种离子流综合作用形成的微弱内向离子流所致。但房颤组肺静脉与左心房HCN2有明显差异，这说明肺静脉的潜在起搏活性，病理状态时HCN2可能起着重要作用。当然这与取材部位的不同可能也有一定关系。HCN1通道并非心室肌和心房肌组织的主要通道亚型，其浓度很少，本实验对照组及房颤组肺静脉与左心房组织中均无HCN1的mRNA表达，这也可能是其表达量很少，本实验未能检测出。从此可以推断，房颤患者心房电重构或If增高可能不是源于HCN1转录水平的异常。本研究发现HCN通道在房颤的发生机制中可能起着重要的作用，从而为房颤的临床药物治疗提供了新靶点。

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